肿瘤细胞转移能力的获得是多种基因的结构、功能和表达情况改变积累的结果。Filder提出的肿瘤异质性学说以及Wessinman提出的将细胞表型与其基因结构及表达的特征相联系的表型克隆思想为认识这些差异基因提供了基础。因此，在本研究中，我们应用基于表型克隆原理的抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)技术，以源于同一母系但具有不同转移能力的一对肺巨细胞癌细胞株为模型，寻找与肺巨细胞癌转移促进相关的基因，并对其中的两条基因进行生物功能验证和作用机制的初步探讨。在SSH实验中，以具有高转移能力的人肺巨细胞癌细胞株PLA-801D为实验方，以不具转移能力的细胞株PLA-801C为驱动方进行杂交，将杂交产物经PCR扩增、纯化后连接至pGEM-Teasy载体并转化JM109大肠杆菌，最终得到了566个含有cDNA差异表达片段的单克隆细菌菌落。经PCR确认这些细菌克隆中含有长度在250-800bp之间的外源基因片段。为进一步确证这些片段在两株细胞中的表达差异，将这些片段的PCR扩增产物利用点样仪点在氨基化的玻片上制成Microarray，然后把PLA-801C、D两株细胞的mRNA通过反转移录标记上不同的荧光素为探针与Microarray进行杂交。杂交筛选的结果表明共有101个细菌克隆所包含的外源片段在PLA-801D株细胞中的表达明显高于其在PLA-801C株细胞的表达。将这101条具有表达差异的片段测序，扣除重复克隆后共有78条不同的片段。经过同源性检索和生物信息学分析，大部分序列均与已知序列高度同源，这些序列主要编码以下几类蛋白：1． 细胞因子及其受体相关蛋白，包括基质细胞来源的因子受体-1(SDFR1) 、类胰岛素生长因子受体结合蛋白-4(IGFBP4) 、甲状腺受体调节蛋白-11等；2． 激酶及其相关蛋白，如磷酸肌醇-3激酶调节亚基-4、 AXL受体酪氨基酸激酶等；3． 其他酶类，如谷丙转氨酶、磷酸酶等；4． 一些未知功能的蛋白或是从核酸序列推出来的假想蛋白；5． 其他还包括热休克蛋白、某些受体蛋白、细胞骨架蛋白、癌基因编码产物等。综合进一步的生物信息学分析和实验的实际情况后，有两条片段被挑出来进行深入的研究，它们的测序编号分别为3和83号。这两条片段在GenBank中具有全长的同源序列，其中3号的同源序列是BC006236，83号的同源序列是BC002420。利用全长序列所提供的信息，合成PCR引物并扩增出了3号序列的同源全长序列，测序后发现该序列与BC006236相比，在第144碱基处有两个碱基“TG”的插入突变，此序列被命名为pmag一1;BC002420序列是从Open Biosystems购得，被称为pmag一2。pmag一1位于人染色体的4q21，由4个外显子组成，基因长约为8.SKbP，pmag一2定位于2q35，由9个外显子组成，基因长约5.2Kbp;这两条序列所有的内含子/外显子均符合GT/AG剪切模式;序列末端均具有典型的“A们叭AA’’添加PolyA尾的信号;在第一个外显子外二者均有明显的启动子结构;还有较为明确的。孙，pmag一1的理论蛋白产物由86个氨基酸残基组成，pmag一2的理论蛋白产物由512个氨基酸残基组成。分析表明二者均符合全长cDNA的种种特性，为全长的cDNA序列，并且经RJ’- PCR、Northem Blot确证了pmag一l、2基因在模型细胞株PLA一80xC、D中存在表达差异。经预测，pmag一1、2理论蛋白产物的一级结构均以。螺旋为主，并且具有糖基化位点、PCK等磷酸激酸磷酸化位点以及某些功能基序(Motif)。此外，还将pmag一1的ORF插入pDsRedl一Nl的多克隆位点构建了表达带有红色荧光标记的融合蛋白的载体pDsRed;一N，M;，利用此载体将pmag一1的可能蛋白产物定位于细胞浆中。 构建pmag一1、2基因的正、反义真核表达载体，将正义表达载体分别转染入具低转移能力的细胞株PLA一801C，反义载体各自转染入具有高转移能力的细胞株PLA一801D后，通过一系列细胞学和分子生物学的实验来研究这两条基因在模型细胞中所起的作用:MTT比色实验和软琼脂集落形成实验表明正义pmag一1转染能够促进模型细胞的增殖，增进细胞的软琼脂集落形成能力;反义pmag一1抑制了细胞中相应基因的表达后使得细胞的增殖能力下降，也抑制细胞的软琼脂集落形成能力;正义pmag一2转染对模型细胞的增殖和软琼脂集落形成能力均无影响，而反义pmag一2对细胞的增殖有抑制作用却未见其对细胞软琼脂集落形成能力的影响;经过流式细胞仪分析细胞群体中细胞周期的组成后发现pmag一1、2均可以增加细胞的分裂指数PI;正义pmag一1、2载体转移都可以增加细胞对细胞外基质的粘附，使得细胞对人工基底膜的侵袭能力增强，相应地当细胞的两种基因被反义载体抑制后，与空载体对照相比，上述两种能力都有所下降;利用激光共聚焦描述显微镜测试了基因转染前后细胞中游离c扩十浓度的变化，发现转染反义表达载体的两种细胞其c扩十的浓度均明显下降;R手pCR和Western Blot实验还证明pmag一1、2对细胞的p53、CD44s、PcNA、MMP一2表达具有影响，具体来说就是正义pmag一1载体的转染可降低P53、增加MMP一2和cD44s在细胞中的含量，反义pmag一1载体的转染可降低CD44s的含量，对MMP一2的影响不大;正义pmag?