中国番茄黄化曲叶病毒AV2基因功能研究

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中国番茄黄化曲叶病毒Y10分离物(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNVY10)为双生病毒科菜豆金色花叶病毒属成员,已发现其在番茄和烟草等作物上造成严重危害。TYLCCNV Y10的基因组为单链环状DNA分子,大小约为2.7 kb,共编码六个蛋白,其中一个348 bp ORF编码AV2蛋白,本论文研究发现该蛋白是RNA沉默抑制子。用pET-32a原核表达载体在大肠杆菌中表达了TYLCCNV Y10 AV2蛋白,以Ni2+-NTA亲和柱纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大白兔制备了TYLCCNV Y10 AV2蛋白的多克隆抗体。含有AV2和GFP基因的植物表达载体经农杆菌共浸润GFP 16c本氏烟叶片,浸润后6天(6 dpi)在紫外下观察发现浸润区有明显绿色荧光,且浸润区周围有红晕,说明AV2具有抑制GFP 16c本氏烟GFP基因局部沉默的功能,但其不能抑制细胞到细胞的短距离沉默信号的传导。而且,在共浸润后30天时紫外下观察发现,GFP 16c本氏烟的系统叶仍发绿色荧光,说明AV2具有抑制GFP 16c本氏烟GFP基因系统沉默的功能。进一步用农杆菌浸润实验发现AV2能抑制GFP 16c本氏烟GFP基因系统沉默信号的传导。上述研究结果表明TYLCCNV Y10 AV2蛋白是RNA沉默抑制子。通过农杆菌浸润本氏烟进行AV2瞬时表达,在浸润48小时后在共聚焦显微镜下观察发现,AV2蛋白分布在细胞质中,并聚集成不规则的细胞质小体。将AV2构建到PVX的表达载体pGR106上,经农杆菌浸润本氏烟后5天会引起叶片的黄脉,后期引起退绿、皱缩、坏死斑、坏死等症状,表明在PVX异源表达系统中AV2蛋白是致病因子。进一步Northern blot分析发现5dpi和7 dpi浸润pGR106-AV2的本氏烟叶片PVX的含量均比浸润空质粒对照pGR106的叶片高。推断可能是因为AV2抑制了植物抗病毒的RNA沉默,使得PVX在本氏烟内大量繁殖。
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