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暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）属于鞘翅目，鳃金龟科，其幼虫是国内外难防的地下害虫之一。对花生、马铃薯和甘薯等农作物为害严重，致使农作物产量大幅度减少，造成巨大的经济损失。苏云金杆菌（简称Bt）杀虫晶体蛋白Cry8类对鞘翅目害虫有特异杀虫活性，其中Cry8Ea对暗黑鳃金龟有较好的杀虫活性。研究Cry8Ea蛋白中肠结合蛋白，为Cry8Ea蛋白的作用机理提供依据，为新型生物杀虫剂的研发和转基因作物的培育提供理论依据。 本研究从河北省保定市3个区县采集土壤样品，筛选出一株对暗黑鳃金龟高效活性的Bt菌株，命名Bt-GWL。镜检发现该菌株的伴孢晶体形态有小圆球型、大圆球型和椭球型。Bt-GWL菌株含有cry1、cry5、cry8、cry9和cry26-28类基因型，SDS-PAGE分析发现Bt-GWL菌株含有分子量为130、116、99、80和55kDa的蛋白。 从该菌株中分离鉴定了cry8基因（GenBank登录号:KC855216），经国际Bt命名委员会正式命名为cry8Ea3。该基因的开放阅读框大小为3495bp，编码1164个氨基酸，预测蛋白分子量为130kDa，等电点为4.68。构建了工程菌株HD8Ea3，成功表达130kDa的蛋白。Cry8Ea3蛋白对暗黑鳃金龟一龄12d幼虫生物活性测定的LC50为103.75μg/g。利用胰蛋白酶消化Cry8Ea3原毒素蛋白，并利用superdex200分子筛层析纯化，获得60kDa的活化片段。 利用Ligand blot和免疫荧光定位实验对Bt Cry8Ea3蛋白在暗黑鳃金龟幼虫中肠的结合蛋白APN进行了研究。克隆并表达了hpapn-psg、hpapn-pse和hpapng、hpapne结构域基因。结果显示，GluZincin和ERAP均能与Cry8Ea3活性片段发生结合。克隆获得暗黑鳃金龟幼虫中肠hpapn-ps和hpapn基因。hpapn-ps基因大小为2304bp（GenBank登录号:KU497558），编码767个氨基酸，预测蛋白分子量为87.3kDa，等电点为5.49，具有APN蛋白的保守序列170GAMEN174和206HEX2H210X18E229，一个O-糖基化位点:T363。hpapn开放阅读框大小为3069bp（GenBank登录号:KU509050），编码1021个氨基酸，预测蛋白分子量为115.6kDa，等电点为3.98，具有APN蛋白的保守序列303GAMEN307和339HEX2H343X18E362，含有18个氨基酸的信号肽，GPI锚定位点位于C-端G1000，26个O-糖基化位点，2个N-糖基化位点N279、N684。 qRT-PCR鉴定hpapn-ps和hpapn基因在暗黑鳃金龟不同组织表达量，发现hpapn-ps和hpapn基因在中肠上的表达量都较高，在其他组织表达量较低。构建了hpapn-ps、hpapn及其结构域基因重组Bacmid，转染昆虫细胞Sf9，Western blot验证其在Sf9中成功表达，免疫荧光实验结果显示细胞表达的APN蛋白及其结构域与Cry8Ea3蛋白在激发光下发出绿色荧光，说明HpAPN-PS和HpAPN能与Cry8Ea3蛋白特异性结合，推断它们为功能性受体蛋白。 结合暗黑鳃金龟幼虫中肠转录组测序结果，利用RACE-PCR方法克隆了hpalp全长基因。该基因开放阅读框大小为1605bp（GenBank登录号:KY922835），编码534个氨基酸序列，预测蛋白分子量为59kDa，等电点为5.18，具有21个氨基酸的信号肽，GPI锚定位点位于C-端D514，2个N-糖基化位点N100和N296。分别构建原核重组表达载体和重组Bacmid-hpalp，均成功表达分子量为59kDa ALP蛋白。qRT-PCR分析发现hpalp基因在中肠上的表达最高，在其他组织表达较低，前肠上的表达量最低。Ligand blot分析结果显示，HpALP蛋白能够与Cry8Ea3活性片段特异结合。 分离鉴定了一种新的Cry8Ea3结合蛋白Ⅴ-ATPase A亚基。利用RACE-PCR技术获得了该基因的全长。hpvaa基因的开放阅读框为1845bp(GenBank登录号:KU497557)编码614个氨基酸，预测蛋白分子量为67.85kDa，等电点为4.9，HpVAA具有ATP-synt_ab_N和ATP-synt_ab_C结构域，保守位点Walker A(GAFGCGKT)和Walker B(SMMAD)。Ligand blot分析结果显示，HpVAA蛋白能够与Cry8Ea3活性片段特异结合。qRT-PCR鉴定hpvaa基因在暗黑鳃金龟不同组织的表达，发现hpvaa基因在马氏管中表达量最高，在后肠和卵中的表达量较高，在脂肪体中的表达量最低。