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研究目的：用99mTc标记AC133.1抗体,体内示踪肿瘤干细胞,为结肠癌临床免疫显像奠定基础。研究内容1.采用流式细胞术检测三种结肠癌细胞的CD133表达水平；2.合成SHNH-AC133.1,制备标记探针99mTc-SHNH-AC133.1,并鉴定标记物的特性；3.建立肿瘤模型,进行体内显像及生物分布研究；4.肿瘤组织流式分析及免疫组化技术检测肿瘤组织中CD133表达情况。通过共聚焦免疫荧光染色技术检测标记物的免疫活性。研究方法1.流式细胞术检测CD133的表达水平分别将HCT116、Lovo及DLD1结肠癌细胞消化成单细胞悬液,离心,PBS洗3遍,细胞重悬后计数,每种细胞取1×106的细胞,加入100μl MACS running buffer重悬细胞,1μl blocking reagent阻断非特异性摄取,加入1ul CD133/2-PE和1μlIgG2b-PE(同型对照)与细胞4℃C孵育10min。流式细胞仪检测分析。2.抗体的标记,纯化、稳定性检测及细胞结合实验利用杂交瘤细胞(HB-12346)接种到Balb/c鼠腹腔产生腹水,采用腹水法提纯AC133.1抗体,设置对照抗体(鼠IgG),将双功能螯合剂SHNH分别与AC133.1及IgG抗体连接并进行99mTc标记。标记物用PD10柱纯化,利用ITLC检测标记物的放射化学纯度,将纯化后的标记物在新鲜人血清中孵育,检测标记物在血清中不同时间点的稳定性。在摄取实验中,细胞分别与99mTc-SHNH-AC133.1和99mTc-SHNH-IgG孵育,阻断实验中细胞与99mTc-SHNH-AC133.1孵育1h前加入500倍(5μg)未标记的AC133.1抗体。3.结肠癌模型的建立,SPECT显像及生物分布建立HCT116、Lovo及DLD1三种结肠癌肿瘤模型,尾静脉注射37MBq (1mCi)99mTc-SHNH-AC133.1或对照99mTc-SHNH-IgG,在4,12,24及36h行SPECT扫描,阻断组在注射显像剂前尾静脉注射60倍(600μg)未标记的AC133.1。SPECT扫描后,不同时间点处死裸鼠,取感兴趣器官称重并测量其放射性,计算各脏器的每克组织百分摄取率(%ID/g。4.肿瘤组织流式分析,免疫组化及共聚焦免疫荧光染色采用流式分析及免疫组化技术检测肿瘤组织中CD133表达情况,进一步验证体内结果。通过免疫荧光技术检测标记物的免疫活性。研究结果1.流式细胞术检测细胞CD133表达量流式结果显示HCT116和Lovo细胞高表达CD133,其CD133表达率分别为84.44±0.40%,68.77±0.20%。DLD1细胞低表达CD133,其CD133表达率为5.1±0.12%(n=3)。2.抗体的标记和体外细胞摄取99mTc-SHNH-AC133.1和99mTc-SHNH-IgG放化纯分别为97.7±2.4%和98.7±1.3%(n=3),比活度分别为4.07MBq/μg和3.33MBq/μg。24h内标记物在人新鲜血清中较稳定。HCT116和Lovo细胞对99mTc-SHNH-AC133.1的摄取率随着时间逐渐增加,4h时分别达到15.38±4.94%和13.85±0.90%,明显高于DLD1细胞对99mTc-SHNH-AC133.1摄取(3.37±0.31%)(P<0.05)。过量未标记AC133.1阻断后,HCT116和Lovo细胞的摄取率明显降低。细胞对99mTc-SHNH-IgG的摄取均比较低。3. SPECT显像及生物分布注射99mTc-SHNH-AC133.1后,SPECT扫描显示HCT116和Lovo移植瘤在12h后随着时间肿瘤部位显影逐渐清晰。DLD1移植瘤中肿瘤部位始终无明显显影。24h时阻断组HCT116和Lovo肿瘤部位显像剂摄取明显减少,注射99mTc-SHNH-IgG的荷瘤裸鼠肿瘤部位显像剂分布接近本底。生物分布显示36h时HCT116和Lovo肿瘤的摄取达到8.82±0.73%ID/g和7.37±0.26%ID/g,而CD133低表达的DLD1肿瘤的摄取为3.40±0.80%ID/g。阻断组HCT116和Lovo肿瘤对99mTc-SHNH-AC133.1的摄取明显减低,在24h时的摄取分别为3.74±0.84%ID/g和2.8±0.60%ID/g。4.肿瘤组织流式分析,免疫组化及共聚焦免疫荧光肿瘤组织流式细胞分析显示HCT116、Lovo及DLD1组织的CD133表达分别为46.31±0.23%,26.57±0.62%和4.93±0.05%,比相应的细胞表达率明显减低。免疫组化显示HCT116和Lovo肿瘤组织CD133表达明显,DLD1肿瘤组织无明显CD133表达。共聚焦免疫荧光结果提示AC133.1标记后未失去生物活性。结论99mmTc标记的AC133.1具有较高的放化纯及比活度。99mTc-SHNH-AC133.1对CD133阳性肿瘤组织有较高亲和性和特异性,用于荷人结肠癌裸鼠的放射免疫显像能取得理想的肿瘤显影,该探针在肿瘤干细胞的示踪及定位诊断中具有良好的应用前景。目的：EphA2广泛表达于许多恶性肿瘤中。SWL是噬菌体库筛选的一种与EphA2具有高亲和力及特异性的多肽。我们合成了一种以多肽为基础的分子探针99mTc-HYNIC-SWL,以研究其在荷瘤裸鼠体内的生物分布和靶向性,并初步探讨其作为EphA2阳性肿瘤显像剂的可行性。方法：多肽SWL以HYNIC为双功能螯合剂,用99mTc标记,测定其放化纯及比活度。采用免疫荧光法检测非小细胞肺癌细胞系A549及黑色素瘤细胞系OCM-1的EphA2受体表达情况。体外细胞饱和实验将A549细胞与不同浓度的标记物孵育,绘制Scatchard plot图并计算其KD值。建立肿瘤模型,以99mTc-HYNIC-SWL为显像剂,对A549和OCM-1荷瘤裸鼠进行SPECT显像。注射过量未标记多肽作为特异性对照组。测定不同时间点标记探针在荷瘤裸鼠体内的生物分布。结果：标记物的放化纯为98.23±0.39%(n=3),比活度为37MBq/μg。免疫荧光结果显示A549高表达EphA2, OCM-1低表达该受体。99mTc-HYNIC-SWL与A549细胞具有高亲和力(KD=2.6±0.7nM)。SPECT显像及生物分布显示在注射显像剂1h后,A549肿瘤对显像剂的摄取(1.44±0.12%ID/g)明显高于OCM-1肿瘤(0.43±0.20%ID/g。注射过量未标记抗体后A549肿瘤部位对显像剂的摄取也明显降低(0.58±0.20%ID/g。这些研究显示99mTc-HYNIC-SWL能与EphA2阳性的肿瘤特异性结合。结论：99mTc-HYNIC-SWL可以通过SPECT显像无创性的监测EphA2的表达。99mTc-HYNIC-SWL体内及体外的生物学行提示其有望成为EphA2阳性肿瘤的特异性显像剂。