【摘 要】
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目的SR-PSOX/CXCL16是近年来新发现的一种趋化因子,与动脉粥样硬化的发展密切相关,但其功能尚不明确。构建抑制人SR-PSOX基因表达的发夹式siRNA慢病毒表达载体,建立利用RNA干扰技术研究人SR-PSOX基因功能的平台。方法在基因功能的研究领域,RNAi可特异、高效、快速地产生针对特定基因的沉默效应,被广泛应用于哺乳动物基因功能的研究。本研究通过Invitrogen公司专用软件对人S
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目的SR-PSOX/CXCL16是近年来新发现的一种趋化因子,与动脉粥样硬化的发展密切相关,但其功能尚不明确。构建抑制人SR-PSOX基因表达的发夹式siRNA慢病毒表达载体,建立利用RNA干扰技术研究人SR-PSOX基因功能的平台。方法在基因功能的研究领域,RNAi可特异、高效、快速地产生针对特定基因的沉默效应,被广泛应用于哺乳动物基因功能的研究。本研究通过Invitrogen公司专用软件对人SR-PSOX基因编码区分析,设计并合成shRNA单链。通过T4连接酶将退火反应合成的shRNA双链克隆入含RNA PolⅢ聚合酶表达元件的pENTRTM/U6入门载体,通过基因克隆技术构建靶向人SR-PSOX基因的发夹式siRNA （shRNA）入门载体,测序正确后使用LR重组技术构建相应的shRNA慢病毒表达载体,PCR鉴定挑选得到正确重组子,脂质体介导转染法将shRNA慢病毒表达载体包装入病毒宿主293 FT细胞,72h后收集含假病毒颗粒的上清液,体外直接感染表达人SR-PSOX基因的人肝癌细胞株（HepG2）。通过RT-PCR、间接免疫荧光法及Western印迹法检测人SR-PSOX基因的表达水平。结果成功地构建了靶向人SR-PSOX基因的发夹式siRNA慢病毒表达载体;shRNA慢病毒表达载体可使人SR-PSOX基因的mRNA和蛋白表达量显著下降,抑制率达到80%,可在培养细胞中有效地沉默人SR-PSOX基因。结论成功构建出靶向人SR-PSOX基因的shRNA慢病毒表达载体,该表达载体可以在培养细胞中有效地沉默人SR-PSOX基因,从而为利用RNA干扰技术研究该基因的功能奠定了基础。
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