向日葵四跨膜蛋白(Tetraspanin,TET)家族基因在向日葵—列当寄生体系中的作用研究

来源 :内蒙古大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xkyx2005
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向日葵列当(Orobanche cumana Wallr.)是一种全寄生植物,主要寄生在向日葵(Helianthus annuus L.)的根部,严重影响向日葵的质量和产量,因此向日葵列当的防治十分重要。四跨膜蛋白(Tetraspanin,TET)广泛存在于哺乳动物、昆虫、真菌及植物中,调控细胞的多种生理过程,在发育和免疫应答中发挥重要作用。植物通过韧皮部运输TET基因特异性标记的外泌体(Exosomes)在植物细胞间进行远距离的信息交流。因此,本论文研究TET基因在向日葵-列当寄生过程中的作用,揭示了TET基因的转录调控机制,为向日葵列当的防治提供理论依据。本研究采用过表达和病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术,以向日葵-列当这一寄生系统为基础,构建了一系列与外泌体特异性标记基因相关的4个TET基因HaTETE3、HaTET6、HaTET8和HaTET10的过表达载体和烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)干扰载体。通过种子浸泡农杆菌(Seed-soak agroinoculation,SSA)的方法侵染向日葵种子,随后接种向日葵列当,对列当吸器数目和生长表型进行了统计和分析,并通过RT-qPCR检测这些相关基因的表达量。主要研究结果如下:(1)首先对向日葵根部进行了外泌体的提取及鉴定,结果表明向日葵根部存在直径约为30~150 nm的外泌体。(2)利用RT-qPCR技术检测了上述HaTET基因在向日葵列当寄生前后的表达情况,结果表明向日葵列当寄生后上述HaTET基因表达量均显著上调。(3)过表达实验中以拟南芥中研究较多的AtTET8和AtTET9基因作为对照,结果显示HaTET基因过表达后列当接种数量增加,其中HaTET8过表达后形成吸器的数量增加最明显,增加了43.3%。干扰表达实验中HaTET基因沉默后列当接种数量显著下降,其中HaTET8沉默后形成吸器的数量减少最明显,减少了58.68%。(4)通过亚细胞定位发现HaTET3、HaTET6、HaTET8和HaTET10蛋白定位于细胞质膜。(5)克隆了HaTET基因的启动子序列并分析了其表达特性,并将其重组到含荧光素酶报告基因(LUC)的表达载体上,利用农杆菌介导的烟草瞬时表达系统检测HaTET启动子的活性。结果发现,不同侵染浓度(OD600=0.2、OD600=0.4、OD600=0.6、OD600=0.8)的ProTET:LUC农杆菌侵染烟草叶片均可驱动LUC报告基因表达。(6)通过外施1 mM水杨酸、1 mM GR24及列当粗提液处理向日葵植株,结果发现SA能够显著促进HaTET基因的启动子活性,而GR24和列当粗提液则对其活性起到抑制作用。
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