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骨质疏松症严重地威胁着人类健康,且随着社会人口老龄化发病率有逐年增加趋势,不仅给患者机体和精神带来痛苦,也使之承受着沉重的经济负担。
降钙素(calcitonin,CT)是一类主要由哺乳动物甲状腺滤泡旁细胞(C细胞)及低等脊椎动物后腮体合成和分泌的32肽激素,1985年被美国FDA批准用于原发性骨质疏松(Osteoporosis,OP)的治疗。降钙素主要通过与破骨细胞表面受体结合而达到抑制破骨细胞增殖,阻止骨溶解作用,因而对骨质疏松症治疗有确切疗效,是目前临床骨质疏松症治疗的一线药物。不过因提取材料来源有限、化学合成生产成本高等问题,使之临床应用受限。利用植物生物反应器生产临床急需的降钙素不仅对上述问题的解决具有积极作用,也为降钙素的生产提供了一条新途径。
本研究尝试利用植物系统——烟草表达一种按植物偏爱密码子设计、合成的新型鲑鱼降钙素msCT [Gly8, Ala16, del-Tyr22],主要开展了以下几方面工作:①构建含“twin T-DNAs”的植物双元表达载体;②烟草遗传转化;③转基因烟草分子检测;④T1代转基因烟草遗传分析。
通过研究取得了如下结果:①成功地构建了含“twin T-DNAs”的植物双元表达载体p35S- 2300-twin T-DNAs::pil-msCT::noster,将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105获得工程菌;②通过农杆菌介导法转化烟草,共获得卡那霉素抗性植株128株,③通过PCR和Southern blot检测,证明外源基因已成功地整合到烟草基因组中,并获得8株独立的转基因烟草植株(5株未整合抗性基因),其外源基因的拷贝数在2-8之间;RT-PCR检测结果显示,外源基因“pil-msCT”在转基因烟草中成功转录,但植株间转录水平存在较大差异;Western blot检测结果表明,具有免疫活性的新型鲑鱼降钙素已成功在转基因烟草中表达;④对T1代5个株系(2、25、93、107和111号)的PCR检测结果显示,其中3个株系(2、93和111号)表现出3 : 1的目的基因分离比,符合孟德尔遗传规律;同时在2个株系(93和111号)中检测到了目的基因(pil-msCT)与标记基因(nptII)分离现象,因此成功地获得了无选择标记(marker-free)的转基因烟草。
本研究仅对利用植物系统表达药用蛋白(pil-msCT)进行了比较初步的研究,有关目的蛋白的分离、生物活性和功能鉴定等工作还有待进一步展开;不过该研究为利用植物系统表达外源蛋白的进一步深入研究做了必要的前期工作,也为“marker-free”转基因植物的获得提供了技术平台和理论依据。