TRB3在肿瘤进展中的作用及其机制探讨

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TRB3(Tribbles Homologue3)是Tribbles同源蛋白家族成员之一,能与多种信号分子相互作用,调节细胞的功能。转录因子Smad3是TGF-β信号下游关键的蛋白分子,参与了多种生理和病理过程。前期研究中,我们利用酵母双杂交筛选系统寻找Smad3的相互作用蛋白,发现TRB3能与Smad3相互作用,并且未见报道。进一步在哺乳动物细胞内进行验证,我们发现TRB3和Smad3能发生特异性的相互作用,主要由TRB3的激酶样结构域(KD)介导。双荧光素酶报告基因活性检测和Western blot显示,TRB3对Smad3介导的转录调节活性及TGF-β1靶基因的表达具有正调控作用。沉默TRB3显著削弱Smad3介导的转录调节活性及TGF-β1靶基因的表达。过表达Smad3能剂量依赖性地增强TRB3的转录活性,TGF-β1刺激进一步加强这种正调控作用。TRB3与TGF-β-Smad3信号之间形成了正反馈调节环。通过GST Pull-down、细胞免疫荧光染色和核浆分离等实验,我们进一步研究了TRB3调节Smad3转录活性的机制,结果发现,TRB3能直接与Smad3的MH2结构域结合,抑制Smad3出核,促进Smad3在细胞核内聚集,稳定了细胞核中Smad3的水平。同时,免疫沉淀结果显示,TRB3通过促进E3泛素连接酶Smurf2的降解,提高pSmad3在细胞中的稳定性,从而发挥对Smad3介导的转录活性的正调节作用。在体外,通过BrdU细胞增殖检测、Transwell细胞迁移和侵袭实验以及Matrigel三维细胞培养,我们发现TRB3对肿瘤细胞的增殖活力、迁移和侵袭能力都具有促进作用。在体内,通过建立裸鼠皮下移植瘤模型和肿瘤细胞实验性肺转移模型,我们发现TRB3能促进肿瘤的生长和转移,沉默TRB3后,肿瘤的生长和转移能力均受到显著抑制。EMT进程帮助肿瘤细胞穿透临近组织,获得侵袭性特征并最终在远端形成转移灶,TGF-p在肿瘤发展后期可通过诱导EMT来维持肿瘤细胞的侵袭表型。通过细胞免疫荧光实验、双荧光素酶报告基因活性检测、RT-PCR和Western blot等发现,TRB3能抑制上皮标志性蛋白E-cadherin和a-catenin的表达,促进间叶表型标志蛋白Fibronectin、Vimentin和N-cadherin的表达,并促进E-cadherin(?)抑制因子Snail和Twist-1的转录,提示TRB3对维持肿瘤细胞的间叶表型具有重要意义。Wnt/β-catenin通路能通过激活靶基因的转录,增强细胞的迁移和侵袭能力。通过Western blot、免疫沉淀和亚细胞组分分离等方法,我们发现TRB3能在转录后水平稳定细胞膜和细胞质中β-catenin的表达,降低β-catenin的磷酸化水平,机制可能与TRB3-GSK-3β、 TRB3-β-catenin相互作用从而抑制β-catenin的降解有关。自噬(autophagy)促进蛋白降解,抑制合成代谢和癌细胞的持续性生长,自噬功能的缺陷可导致肿瘤的发生。TRB3对细胞的自噬信号具有抑制作用。沉默TRB3能促进LC3-Ⅱ、Beclin1和PI3KC3的表达,抑制Akt、mTOR和P62的表达,细胞质中出现大量自噬泡。结合Annexin Ⅴ-FITC和TUNEL凋亡检测以及Caspase-3的表达,我们认为,沉默TRB3促进肿瘤细胞发生凋亡,且这种程序性细胞死亡是具有自噬特性的,TRB3对肿瘤细胞的自噬相关性死亡具有抑制作用。P62是反映自噬动态过程的重要指标,TRB3能与P62发生相互作用,这种作用主要由P62的UBA和LIR结构域所介导。综上所述,我们发现TRB3是Smad3的相互作用蛋白之一,两者间的相互作用尚属首次报道。通过两者间的相互作用,TRB3可促进Smad3介导的转录调节活性,提高肿瘤的增殖、侵袭和转移能力,在肿瘤细胞EMT进程中发挥关键作用,并抑制肿瘤细胞的自噬性死亡。TRB3可能成为抗肿瘤转移的一个潜在靶点。
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