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鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是重要的海水养殖动物病原菌,广泛生存于各种不同的海洋环境中。海洋细菌具有多种适应海洋环境的策略,而鳗弧菌适应海洋生态环境的机制研究不多。细菌的Ⅵ型分泌系统(T6SS)是一种新的蛋白分泌系统,在许多海洋细菌的致病性和环境适应性方面发挥重要作用。本文开展了鳗弧菌MHK3株T6SS的表达及其介导的抑菌作用的研究,旨在深入了解鳗弧菌的生态适应机制。主要的研究内容和结果如下：1.不同培养条件对鳗弧菌MHK3 T6SS表达和分泌功能的影响。Hcp(溶血素共调蛋白)是依赖T6SS分泌的一个基质蛋白,有T6SS的细菌能够将Hcp分泌到细菌外是T6SS具有功能的一个重要特征。在实验室适宜培养条件下,鳗弧菌MHK3的T6SS具有分泌Hcp的功能。本研究利用qRT-PCR和Western bolt方法,分析MHK3在各种温度(10℃、16℃、28℃、37℃)、盐度(0.2%、0.5%、1.0%、3.0%、5.0%NaCl)和pH(6、7、8、9、10)条件下表达和分泌Hcp的特征。结果显示,Hcp在10-37℃培养时均可表达和分泌,在转录水平上,Hcp mRNA表达量随温度升高而降低,在10℃的表达量最高：在蛋白水平上,胞内Hcp蛋白量在10-37℃变化不大,而胞外Hcp蛋白量在10-28℃较高,在37℃较低。Hcp在0.2-5%NaCl均有表达和分泌,在转录水平上,Hcp mRNA表达量在3% NaCl条件下最高,在其它盐度条件下的表达量均较低；在蛋白水平上,胞内和胞外Hcp蛋白量在0.5-5%NaCl均较高,在0.2%NaCl条件下较低。Hcp在pH 6-10均有表达,在转录水平上,Hcp mRNA表达量在pH8时最高；在蛋白水平上,胞内和胞外的Hcp蛋白量随pH提高而减少,在pH 10时MHK3不分泌Hcp。蛋白稳定性实验结果显示,分泌到胞外的Hcp蛋白8h内保持稳定而不降解。上述结果表明,在海洋环境的物理因子变化较剧烈的条件下,鳗弧菌依然能够表达和分泌Hcp,发挥T6SS的分泌功能。2.密度感应系统调节基因luxO对MHK3 T6SS表达和分泌的影响。构建了MHK3 luxO基因的缺失突变株(ΔluxO),研究发现在实验室培养条件下ΔluxO的生长速率变慢。通过qRT-PCR和Western blot比较分析MHK3野生株及突变株ΔluxO、AvasC (MHK3 T6SS结构基因vasC的缺失株)在不同生长时期(OD540nm=0.1、0.6、1.0、2.0)Hcp的表达和分泌。结果显示,与野生株MHK3相比,在整个生长期ΔluxO和ΔvasC的Hcp mRNA转录水平很低,AluxO的胞内和胞外没有检测到Hcp蛋白,而仅在AvasC胞内能检测到Hcp蛋白。这些结果说明,luxO基因在转录水平上影响hcp基因的表达；vasC基因的缺失导致T6SS结构不完整,影响Hcp分泌到细胞外。3.鳗弧菌MHK3 T6SS介导的抑菌作用。分别建立野生株MHK3 (T6SS具有分泌Hcp的功能,Hcp+)及其突变株ΔluxO(T6SS没有分泌Hcp的功能,Hcp-)、AvasC (Hcp)与大肠杆菌(Escherichia coli)和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的共培养体系,相互作用4h后进行细菌计数。结果显示,在MHK3 (Hcp+)与E. coli (Hcp-)或E. tarda (Hcp-)的共培养体系,MHK3 (Hcp+)的数量没有明显变化,而E.coli (Hcp-)或E. tarda (Hcp-)的细菌数量下降2-3 logs；在ΔluxO(Hcp-)或AvasC (Hcp-)与E. coli (Hcp-)或E. tarda (Hcp-)的共培养体系,所有的细菌数量没有明显变化。上述结果表明,T6SS介导鳗弧菌MHK3抑制E. coli和E.tarda的生长。