化学性缺氧对原代培养大鼠心肌细胞葡萄糖转运蛋白的影响前言急性心肌缺血／缺氧伴随着葡萄糖转运和代谢的增加，这对保护心肌免受不可逆性缺血／缺氧损伤非常重要，然而关于心肌缺血／缺氧激发葡萄糖转运的机制仍不清楚。已知葡萄糖经细胞膜进入细胞是心肌葡萄糖代谢的第一步，其转运速度由细胞膜上易化性葡萄糖转运蛋白（glucose transport proteins，GLUTs）GLUT1和GLUT4的数量决定。体内和体外的研究均表明胰岛素可诱导心肌GLUT1和GLUT4从细胞内膜转位至细胞膜，通过增加心肌细胞膜GLUT1和GLUT4数量进而易化葡萄糖转运。在此，我们以原代培养的大鼠心肌细胞为研究对象，利用叠氮钠（sodium azide，NaN₃）---特异性细胞色素C氧化酶抑制剂，制作缺氧模型模拟心肌细胞化学性缺氧，通过与胰岛素的对比来研究缺氧单独或联合胰岛素对大鼠心肌细胞GLUTs转位的影响。旨在进一步探索心肌细胞缺氧条件下能量利用的分子生物学机制，以对缺血／缺氧心肌的保护提供理论依据。实验材料和方法1．大鼠心肌细胞原代培养消化分离的Wistar大鼠乳鼠（中国医科大学实验动物部）心室肌细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM中，利用差速黏附技术提纯心肌细胞后，以10⁵个细胞／ml的密度接种于24孔培养板或25ml培养瓶，置37℃，10％CO₂培养箱（德国KENDRO／HERAEUS）中静止培养，每2-3天换液一次。2．2-[³H]-脱氧葡萄糖的摄取用0～50mmol／g胰岛素溶液（溶于DMEM）37℃孵育细胞5～60分钟，再用1μCi／ml 2-[³H]-脱氧葡萄糖（2-[³H]deoxyglucose，2-[³H]DG）（北京原子高科核技术有限公司）孵育细胞60min，冷根皮素（phloretin）终止反应。纸片法行液闪测量。3．制备心肌细胞缺氧模型及分组PBS冲洗细胞后，将原代培养的大鼠心肌细胞随机分为对照组，胰岛素组（20mmol／L胰岛素），叠氮钠模拟的化学性缺氧组（1mmol／L叠氮钠）及化学性缺氧联合胰岛素组（1mmol／L叠氮钠+20mmol／L胰岛素）。4．分离细胞膜与细胞内膜孵育结束后，离心收集细胞并匀浆。利用差速离心及非连续蔗糖密度梯度（32％，40％，50％）分离细胞膜和细胞内膜。所有过程4℃进行。5．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹杂交（Western-Blot）等量蛋白样品加入到预制的10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，再转印到PVDF膜上。封闭后，分别同多克隆抗GLUT4抗体（美国Chemicon公司）及多克隆抗GLUT1抗体（美国Santa公司）4℃孵育过夜。再同相应二抗室温孵育2小时，然后将膜浸入显色液中显色分析结果。结果1．原代培养的大鼠心室肌细胞一周左右长满瓶皿底壁，形成细胞单层，搏动同步化。2．0.1～50mmol／L胰岛素溶液均使原代培养大鼠心肌细胞对2-[³H]DG平均摄取率增加。胰岛素浓度为20mmol／L、作用时间为30分钟时，细胞对2-[³H]DG摄取率最高。3．Western-Blot分析结果表明，同对照组相比，各处理组细胞膜GLUT4表达量显著增加；同时，细胞内膜GLUT4表达量相应下降，提示各实验组GLUT4在不同程度上发生了从细胞内膜向细胞膜的转位。其中，胰岛素组GLUT4转位程度高于缺氧组，缺氧联合胰岛素组则发生最大程度转位，提示二者对GLUT4转位发生了叠加效应。4．各实验组细胞膜GLUT1表达量也有所增加，但增加程度不如GLUT4明显；同样条件下，细胞内膜GLUT1表达量相应下降，提示各实验组GLUT1也发生不同程度从细胞内膜向细胞膜的转位。与GLUT4相似，胰岛素组GLUT1转位程度高于缺氧组，胰岛素联合缺氧组转位程度最大，提示二者对GLUT1转位也发生了叠加效应。讨论代谢应激时，如缺血或缺氧，葡萄糖成为心肌主要能量来源。已知代谢应激期间心肌葡萄糖摄取的增加对细胞存活和心肌功能有保护性作用。因此明确心肌葡萄糖转运机制对病理状态下心肌能量代谢的纠正及心功能改善具有重要临床意义。体外原代培养的大鼠心肌细胞排除了体内神经体液因素的干扰，又最大程度保持心肌原有特性，且实验因素的浓度和活动易被调节，因此能成为研究心肌细胞信号转导通路的一个较好模型。我们利用叠氮钠（NAN₃）模拟细胞化学性缺氧，研究胰岛素、缺氧两者单独或联合作用对原代培养的大鼠心肌细胞GLUTs转位的影响，进一步探索心肌细胞缺氧条件下葡萄糖转运机制。数据表明，同对照组相比，胰岛素和叠氮钠模拟的化学性缺氧单独或联合作用均增加了体外原代培养的大鼠心肌细胞膜GLUTs的表达量，而细胞内膜GLUTs相应下降，提示在此条件下心肌细胞发生了GLUTs由细胞内膜向细胞膜的转位。数据表明胰岛素诱导的GLUTs转位幅度大于化学性缺氧的作用，而化学性缺氧后给予胰岛素则激发了更大幅度的转位，这说明化学性缺氧联合胰岛素对GLUTs转位发生了叠加效应。缺氧和胰岛素引起GLUTs转位程度的不同很可能是由于激发了不同的细胞内信号转导通路，二者对GLUTs转位的叠加性也证实了这一点。其中，胰岛素激发GLUT4转位依赖于PI3K途径；而AMPK则是缺氧缺血调节GLUT4转位的一个主要因素。同GLUT4类似，胰岛素诱导的细胞GLUT1转位需要PI3K的激活；但缺血激发GLUT1转位与PI3K信号机制无关，提示调节GLUT1转位至少存在两条不同的路径。数据还表明胰岛素和缺氧诱导的GLUT1转位幅度小于GLUT4，表明在心肌细胞中调节GLUT1转位的方式不同于GLUT4。化学性缺氧联合胰岛素对GLUTs转位的叠加效应有重要的临床意义。此作用可更大程度增加细胞膜表面GLUTs数量，使细胞外葡萄糖更多的摄入细胞内，以满足缺血／缺氧心肌的能量需要，有助于缺血／缺氧心肌代谢和机械功能的稳定。结论1．胰岛素增加了原代培养大鼠心肌细胞对2-[³H]DG的摄取率，20mmol／L的胰岛素浓度孵育细胞30分钟使心肌对2-[³H]DG摄取率达到峰值。2．化学性缺氧和胰岛素诱导原代培养大鼠心肌细胞GLUTs（GLUT4和GLUT1）发生不同程度从细胞内膜向细胞膜的转位，其中胰岛素诱导的GLUTs转位幅度大于化学性缺氧的作用。3．化学性缺氧联合胰岛素对GLUTs转位具有叠加性。