第一章：高龄小鼠卵母细胞中细胞器形态变化的研究目的高龄女性生育能力下降主要表现为卵母细胞数量减少和质量下降,卵母细胞质量的下降也即卵子老化。卵子老化后其细胞质中的细胞器会发生一系列的变化,从而引起卵子成熟,受精及胚胎发育的异常。本课题主要研究高龄昆明小鼠卵母细胞主要细胞器如纺锤体、染色体排列和定位的变化规律,以及线粒体和皮质颗粒分布变化规律。方法将昆明小鼠按月龄分为年轻组(4～8个月)和高龄组(48～52个月)。雌性小鼠腹腔内注射孕马血清促性腺激素(PMSG) 10IU/只,行超促排卵,48h后腹腔内注射绒毛膜促性腺激素(hCG) 10IU/只,注射hCG后14h收集输卵管的卵冠丘复合物。用80IU/m1透明质酸酶脱去卵母细胞周围颗粒细胞,多聚甲醛固定,抗小鼠a-tubulin单克隆抗体染色纺锤体的微管,罗丹明标记的鬼笔环肽染色微丝,FITC结合的小扁豆凝集素染色皮质颗粒,Mito Tracker Green FM染色线粒体。激光共聚焦显微镜下观察免疫荧光染色的纺锤体、染色体的形态和排布,线粒体和皮质颗粒的分布变化情况。结果纺锤体和染色体：正常卵母细胞纺锤体呈完整的纺锤状排列,形态均匀一致,染色体均匀排列在中期板内。高龄组小鼠卵母细胞纺锤体形态异常率71.78%±1.27%,明显高于年轻组小鼠卵母细胞纺锤体形态异常率18.93%±1.27%(P<0.01)；高龄组小鼠卵母细胞染色体排列异常率65.16%±1.52%,明显高于年轻组小鼠卵母细胞染色体的异常率32.24%±1.10%(P<0.01)。微丝：年轻组小鼠其微丝分布在整个卵母细胞的胞质中,尤其在纺锤体、染色体区含量更高,染色更加明显。高龄小鼠卵母细胞微丝多为散乱的分布于胞质中或在染色体周围区域未见相对集中。线粒体：正常线粒体均匀分布于MII期卵母细胞的整个胞质中,于染色体附近有所聚集；对两组线粒体荧光强度分析显示高龄组小鼠卵母细胞荧光强度18.82±6.42明显低于年轻组小鼠卵母细胞线粒体荧光强度44.44±32.97(P<0.01)。皮质颗粒：正常卵母细胞皮质面可见皮质颗粒呈均匀细致状分布；赤道面观察可见皮质颗粒呈单层细致连续的光环状分布,胞浆内未见皮质颗粒分布,大多为成熟的皮质颗粒我们称之为Ⅲ级皮质颗粒分布。年轻组小鼠卵母细胞Ⅲ级皮质颗粒占94.04%±0.71%。高龄组卵母细胞皮质面可见皮质颗粒呈团块状分布、且分布不均匀,赤道面可见皮质颗粒单层光环断裂、呈不连续状分布,且胞浆内可见皮质颗粒内迁的现象,多为Ⅰ级或Ⅱ级皮质颗粒(48.73%±3.28%),Ⅲ级皮质颗粒为51.00%±1.00%,明显低于年轻组小鼠卵母细胞Ⅲ级皮质颗粒(P<0.01)。结论高龄小鼠卵母细胞中各主要细胞器(纺锤体、染色体、微丝、皮质颗粒)异常率明显增加,可能是导致高龄受孕率低的主要原因。第二章：白藜芦醇在高龄小鼠卵母细胞成熟中的作用研究目的白藜芦醇存在于红葡萄酒及大部分植物中,具有抗炎症、抗衰老、抗癌等多个生物学功能,除此之外,白藜芦醇还有保护细胞线粒体的功能,保护细胞免受活性氧等自由基的危害,保护生育能力的功能。本课题主要研究白藜芦醇在高龄小鼠卵母细胞成熟及胚胎形成过程中的作用；观察白藜芦醇对高龄小鼠卵母细胞细胞器的改善作用并探讨其作用机制。方法用无菌注射器刺破高龄小鼠卵巢获取未成熟生发泡(germinal vesical,GV)期卵母细胞,将四种不同浓度的白藜芦醇(0,0.1,1.0,10μM/L)添加到卵母细胞体外成熟IVM (in vitro maturation)培养液中,16h后观察卵母细胞的成熟情况,确定白藜芦醇的最佳使用浓度；继续培养观察其受精,卵裂,以及囊胚形成情况；对成熟的卵母细胞进行免疫荧光染色,通过共聚焦显微镜观察成熟后卵母细胞线粒体的质量、数量以及纺锤体和染色体排列的变化规律；实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测SIRT1、CAT、SOD1、GPx4基因的表达情况。结果在1.0μM/L白藜芦醇添加组中,高龄小鼠GV期卵母细胞的成熟率为93.15%±1.46%,明显高于其它组卵母细胞的成熟率(P<0.01)。1.0μ M/L白藜芦醇添加组中,成熟卵母细胞的受精率,囊胚形成率分别与对照组相比为：76.93%±2.40%vs 60.86%±2.13%,P<0.01；58.61%±2.22% vs 41.23%±1.69%,P<0.01,明显高于对照组。另外,在1.0 μ M/L白藜芦醇添加组中,成熟卵母细胞其线粒体的荧光强度明显高于对照组(93.01±19.34 vs 63.06±13.11,P<0.01)；且异常形态的纺锤体、异常排列的染色体率明显低于对照组(分别为：34.42%±3.92% vs 60.69%±4.14%,P<0.01；39.15%±3.91%vs 61.94%±4.82%,P<0.05)。再者,添加1.0μM/L白藜芦醇组所形成的成熟卵母细胞中,其SIRT1、抗氧化基因CAT、SOD1、GPx4的表达明显增高。结论(1)IVM培养液中添加的白藜芦醇通过改善卵母细胞线粒体的功能,降低卵母细胞纺锤体、染色体的异常率,提高SIRT1、抗氧化基因CAT、SOD1、GPx4的表达,明显提高高龄小鼠卵母细胞的成熟率,改善卵母细胞的质量,从而提高卵母细胞的受精率及囊胚形成率。(2) 1.0μM/L为IVM培养液中最佳的使用浓度。第三章：白藜芦醇在高龄女性卵母细胞体外成熟中的作用研究目的在辅助生育治疗过程中,高龄女性由于卵子数量的减少以及卵子质量的下降,从而导致高龄妇女的胚胎形成率明显下降,严重影响高龄患者辅助生殖治疗的妊娠率以及胚胎种植率。白藜芦醇在抗氧化、抗衰老、保护卵母细胞等一系列过程中发挥了重要的作用。本课题主要研究白藜芦醇在高龄女性患者未成熟卵母细胞体外成熟过程中的作用,以及体外培养成熟后卵母细胞线粒体数量和质量的变化规律,纺锤体、染色体排列的变化规律,从而探索提高高龄女性患者未成熟卵母细胞的体外成熟率以及改善卵母细胞质量的有效培养环境。方法高龄女性来源于年龄大于等于38周岁于2014年2月至2015年2月就诊于山东大学附属生殖医院的患者,其GV期卵母细胞采用因男方精子原因或其他引起受精障碍因素行卵母细胞内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)的不孕症患者中部分未成熟的卵母细胞。在高龄女性患者中将获得的GV期卵母细胞在高龄小鼠实验后确定的最佳白藜芦醇添加浓度(1.0 μM/L)及对照组中培养24h、36h分别观察所成熟的卵母细胞情况；对成熟的卵母细胞进行免疫荧光染色,通过共聚焦显微镜观察成熟后卵母细胞线粒体的质量、数量,纺锤体、染色体排列的变化规律。结果高龄女性GV期卵母细胞在1.0μM/L白藜芦醇添加组的未成熟卵母细胞培养液中培养24h、36h,其MII期卵母细胞的成熟率明显高于对照组(分别为：55.26%vs 37.84%, P<0.05; 71.05% vs 51.35%, P<0.05)。在高龄女性1.OμM/L白藜芦醇添加组成熟的卵母细胞其线粒体的荧光强度明显高于对照组(53.02±15.10 vs 31.14±6.05,P<0.05)；且异常形态的纺锤体、异常排列的染色体率明显低于对照组(分别为：68.75% vs 88.89%,P<0.05；68.75% vs 88.89%,P<0.05)。结论白藜芦醇的添加提高了高龄女性GV期来源的卵母细胞的成熟；提高了培养成熟后卵母细胞线粒体的数量,改善了线粒体的质量,并且其正常形态的纺锤体、染色体的形成率也明显增高。因此,白藜芦醇可有效改善高龄女性卵母细胞质量,亟待大样本的临床试验进一步证实。