论文部分内容阅读
研究背景:肢体远端缺血预处理(Remote ischemic preconditioning,RIPC)通过短暂、亚致死性的远端肢体缺血再灌注,启动内源性保护机制,可有效诱导脑缺血耐受,减轻后续脑缺血再灌注损伤(I/R),改善缺血性脑卒中患者的预后。由于RIPC具有安全、无创、有效、简便等特点,而被认为是具有较好临床转化前景的一种预处理方式,对缺血或炎症相关的急性、亚急性及慢性神经系统疾病有较好的应用前景。研究表明,RIPC的远端器官保护机制可能与体液循环、外周传入神经及自主神经的传导、免疫以及一系列分子和通路相关。但RIPC抗脑缺血神经保护作用的确切机制比较复杂,尚不明确。阐明RIPC诱导脑缺血耐受的机制,对脑卒中及其他脑缺血性疾病的治疗具有重要的理论和实践价值。我们的前期研究发现,脑缺血预处理(cerebral ischemic preconditioning,CIP)可激活缺血脑区Notch1介导抗脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。本研究旨在探讨RIPC能否通过激活缺血脑区Notch1信号,产生抗脑缺血再灌注损伤的神经保护作用,阐明Notch1及NF-κB信号通路在RIPC诱导的脑缺血耐受中的作用。实验方法:采用SD大鼠的大脑中动脉栓塞/再灌注(MCAO/R)模型和原代海马神经元细胞的糖氧剥夺/复糖复氧(OGD/R)模型分别模拟I/R损伤的体内及体外模型。RIPC在MCAO损伤前72h开始,连续三天,每天5min*4次左下肢缺血/再灌注。采用侧脑室注射通路抑制剂DAPT和sh-Notch1慢病毒干扰技术以分别抑制体内和体外实验中Notch1通路的信号传导。再灌注24小时后,评估神经功能缺损评分;TTC染色法检测脑梗死体积;Tunel/NeuN免疫荧光双标及Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测神经细胞凋亡;CCK-8法检测神经元细胞活力;Westerm blot 检测 Notch1 及 NF-κB 通路相关蛋白 NICD、Hes1、p-Ikkα/β、p-NF-κB p65及Bcl-2,Bax的表达水平。实验结果:第一部分动物实验一:RIPC可明显减轻MCAO/R损伤,改善MCAO/R损伤后大鼠的神经功能评分,缩小脑梗死体积(P<0.01)。RIPC可以显著提高RIPC+MCAO/R 组 Notch 通路和 NF-κB 通路相关蛋白 NICD,Hes1,IKKβ和 NF-κB p65的表达。第二部分细胞实验:糖氧剥夺预处理(OGD-Pre)可以有效提高海马神经元细胞OGD/R损伤后第1、3、7天的细胞活力(P<0.05),减少OGD/R损伤后3、7天神经元细胞的总凋亡率。用Notch1-RNAi抑制Notch1信号后,OGD-Pre对神经元细胞活力的保护和抗凋亡作用被逆转。同时,Notch1-RNAi阻断Notch1信号也可以提高OGD/R损伤后第3、7天的细胞活力,减少海马神经元细胞凋亡比率。OGD-Pre可以预先激活Notch1和NF-κB信号通路,提高NICD,Hes1,p-Ikkα/β,p-NF-κB p65 和 Bcl-2 蛋白的表达。Notch1-RNAi 阻断 Notch1信号后,IKKα/β及NF-κB p65磷酸化水平明显下降,提示NF-κB通路活性受到Notch1信号的调节。第三部分动物实验二:RIPC可以减少MCAO/R损伤后海马区神经元细胞凋亡。DAPT阻断Notch1信号后RIPC改善神经功能评分,缩小脑梗死体积,减少神经元细胞凋亡的神经保护作用被逆转。同时,与MCAO/R组相比,DAPT阻断Notch1信号也可以改善MCAO/R损伤后大鼠神经功能评分,缩小脑梗死体积,减少神经细胞凋亡。RIPC可激活脑缺血区Notch1和NF-κB信号通路,提高通路相关蛋白 NICD,Hes1,p-Ikkα/β,p-NF-κB p65,Bcl-2 的表达。DAPT 抑制同侧脑区Notch 1信号后,IKKα/β及NF-κB p65磷酸化水平明显下降(P<0.05),NF-κB通路活性受到Notch1信号的调节。结论:RIPC介导的抗脑缺血再灌注损伤的保护作用与预先激活缺血脑区神经元细胞的Notch1信号并上调NF-κB信号通路活性有关。在RIPC介导的神经保护作用中,NF-κB信号通路作为Notch1通路的下游效应通路,其活性受Notch1通路的调控,共同参与抗缺血再灌注损伤作用。