论文部分内容阅读
胰腺纤维化是与慢性胰腺炎（chronic pancreatitis）相伴随的特殊的组织病理学特点,往往导致胰腺功能性组织丧失,富含连接组织的细胞外基质（extracellularmatrix ECM）在胰腺内沉积等后果。然迄今为止,胰腺纤维化过程精确的调控机制仍未明了。胰腺星状细胞（pancreatic Stellate cell,PSC）是产生胰腺纤维化的关键细胞,并最终导致慢性胰腺炎的形成。在此过程中有多种细胞因子参与,而各种因子的产生途径、相互作用机制不尽相同。激活素（Activin）最早是在性腺发现的糖蛋白激素,后来发现其作用不仅限于性腺,具有多种生物学功能,属于TGF-β超家族的成员,其三种受体属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。激活素参与机体炎症反应和组织修复过程,一定水平激活素不但呈剂量依赖性的促进PSC增殖并表达a平滑肌肌动蛋白（a-SMA）,而且可增强其胶原蛋白分泌。内皮素（endothelin ET）作为迄今所知最强的缩血管物质,其作用机制是通过增加PSC的胶原合成和分泌,以及提高PSC的摄取与合成能力有关。整合素（Integrin）是位于细胞表面的糖蛋白受体家族分子,为介导细胞—细胞以及细胞—细胞外基质,且作为介导信号传递的膜分子,在许多重要的病理生理过程:如细胞增殖、分化、伸展和迁移、凋亡、炎症反应、组织修复和肿瘤侵袭转移等中起着十分重要的作用。细胞因子在促进PSC活化、增殖、迁徙过程中,都要通过细胞信号传导通路对PSC进行控制。c-Jun氨基端激酶（c-Jun-terminal kinase,JNK）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activaed proren kinase,MAPK）信号传导通路家族成员。MAPK广泛参与细胞的多种生命过程,包括生长、分化、细胞周期调节,肿瘤发生,细胞凋亡等。JNK主要参与ECM的合成。汉丹肝乐是在临床辩证的基础上,以丹参、黄芪、汉防己碱、银杏、赤芍等五味中药组方而成。已有的研究证实,它可通过减轻肝细胞脂质过氧化、保护肝细胞、抑制HSC增殖及胶原合成、提高胶原酶活性、并促进胶原蛋白降解等多种机制,来发挥抗肝纤维化效应。本课题采用细胞生物学和分子生物学技术（包括免疫组化、RT-PCR,westernblot等）,检测激活素、整合素、内皮素在胰腺组织损伤修复及纤维化形成过程中的动态变化以及应用药物干预胰腺纤维化的形成。旨在探讨激活素、整合素、内皮素在慢性胰腺炎胰腺纤维化发生、发展中的作用和细胞内传导途径以及药物干预效果。本课题主要分为三部分:（1）慢性胰腺炎大鼠模型的建立;（2）激活素、整合素、内皮素在慢性胰腺炎胰腺组织中的表达;（3）汉丹肝乐对大鼠慢性胰腺炎胰腺纤维化干预的研究。实验方法1、实验动物模型的建立通过向Wistar大鼠胆胰管输注含2%三硝基苯磺酸（TNBS）的10%乙醇PBS溶液复制慢性胰腺炎动物模型,在胆胰管中注射等量的10%乙醇PBS溶液复制对照组,干预组（模型组动物）术后第三天给予口服汉丹肝乐,大鼠术后分1、2、3、4、5、6、7周等观察时点。2、实验标本的制备抽取血清分别应用速率法、电化学发光免疫法测定血清淀粉酶及C肽;取胰腺组织部分即刻按透视电镜观察胰腺组织超微结构要求制片后行电镜观察,部分胰腺组织行组织学标本制备,部分胰腺组织-80℃保存。3、免疫组化组织学标本经脱蜡、脱苯,水化后采用免疫组化法检测FN胶原、ACT-A、ET-1、Integrinα5β1、JNK、a-SMA,结果判定:光镜下胰腺间质出现黄、棕色为阳性染色。免疫组化半定量分析表达程度:应用彩色图象分析系统,对各组大鼠胰腺切片随机选取10个视野测量,计算阳性染色面积占胰腺视野面积比,并进行定量分析,以染色面积在标本中所占百分比表示。4、Masson胶原染色组织学标本经脱蜡、脱苯,水化后采用采用Masson胶原染色法行胰腺组织胶原染色,结果判断:胰腺腺泡呈红色,胶原纤维呈蓝色或绿色。胶原面积半定量分析:选取每一例标本10个不同视野下相同大小的区域,测算出胶原面积占该区域的百分比,取其平均值作为胶原的相对含量值。5、RT-PCRRT-PCR技术检测模型组激活素mRNA、整合素mRNA、内皮素mRNA的表达。实验所用物品的去Rnase处理,组织总RNA的提取,逆转录（RT）反应,聚合酶链反应（PCR）,基因扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳,拍照。结果分析:将凝胶电泳图像输入,自动电泳凝胶成像分析系统,进行表达强度分析,按下公式计算相对系数:相对系数=细胞因子表达强度/β-actin表达强度。每张电泳图重复进行3次,计算均数。6、western blot（蛋白印迹）western blot法检测α-SMA、JNK表达。组织中总蛋白的提取,聚丙稀酰胺凝胶（SDS一PAGE）电泳,转膜,印迹（blotting）,将胶片图像输入凝胶成像分析系统,进行表达强度分析,按下公式计算相对系数:相对系数=蛋白表达强度/β-actin表达强度,每张图像重复进行3次,计算均数。结果1、实验动物大体及形态学变化模型组大鼠术后第一周内体重明显减轻,其后体重有所增加,但与对照组相比,体重仍较轻。模型组大鼠病理形态变化:自术后第二周胰腺小叶周围及间质内有纤维化形成,第4周达高峰,第5、6、7周胰腺组织变化基本同第4周。2、透视电镜观察模型组第1、2周胰腺间质内可见少量活化的胰腺星状细胞（PSC）,其内维生素A脂滴消失,胰腺腺胞线粒体肿胀、有多种囊泡形成。第3周胰腺组织间质内、透明活化的PSC以及成纤维细胞明显增多,间质内纤维增多,腺胞内线粒体明显肿胀、透明。第4周时,胰腺组织间质内活化的PSC、成纤维细胞、巨噬细胞明显增多,间质内可见大量的纤维成分。胰腺腺胞内粗面内质网明显扩张,腺胞体积减少,第5、6、7周胰腺组织变化基本同第4周。3、血清学检测模型组各时点淀粉酶测定值较对照组均明显升高,模型组C肽测定值在术后第1、2周较对照组无差异,3～7周较对照组均明显降低4、免疫组化检测（1）FN胶原在模型组表达逐渐上调,于第四周达高峰,明显高于干预组及对照组,干预组较模型组有所下调。模型组第5、6、7周胰腺组织变化基本同第4周。（2）对照组:激活素在腺泡细胞、胰管壁、胰腺间质内低表达;模型组与干预组:阳性细胞多位于胰腺间质、纤维间隔区、炎症细胞浸润区表达。模型组在1-7周呈逐渐上调趋势,明显高于对照组,尤以第4周后明显,干预组较模型组有所下调.（3）对照组:内皮素在胰腺腺泡、胰管壁有弱表达;模型组与干预组:阳性细胞多位于纤维化区域及炎症细胞浸润区。模型组分别在1、4周出现两个高峰,明显高于对照组,干预组较模型组明显下调。（4）对照组:整合素在胰腺腺泡、胰管壁有弱表达;模型组及干预组:阳性细胞多位于纤维化区域及炎症细胞浸润区。模型组表达逐渐上调,于3,4周达高峰,随后表达下调,明显高于对照组,干预组较模型组明显下调。（5）对照组:JNK在胰腺腺泡、胰腺间质内少量表达;模型组及干预组:阳性细胞多位于胰腺间质及纤维化区细胞浆和细胞核中,两者明显高于对照组,干预组较模型组明显下调。（6）对照组:α-SMA少量表达在血管壁;模型组及干预组:α-SMA表达在纤维化区域及胰管周围,两者明显高于对照组,干预组较模型组明显下调。5、胰腺组织胶原分布情况对照组于胰腺组织纤维间隔可见少量胶原纤维染色;模型组胰腺组织中可见大量呈蓝色的胶原纤维沉积,小叶间及胰管周边集中,小叶内可见散在的胶原纤维分布,干预组较模型组小叶间及胰管周围胶原纤维沉积均明显减少,小叶内仅见少量胶原纤维沉积.6、RT-PCR（1）激活素mRNA在模型组表达在第1-3周时测不到,4周后逐渐升高,6-7周为最高.（2）内皮素mRNA在模型组表达在第1、4周出现两个高峰.（3）整合素在mRNA在模型组表达逐渐升高,第4周达高峰,随后下调.7、western blot（1）α-SMA在胰腺组织中蛋白表达与对照组比较:模型组、干预组α-SMA表达明显上调;α-SMA在干预组表达较模型组明显下调。（2）JNK在胰腺组织中蛋白表达与正常对照组比较:模型组、干预组JNK表达明显上调;JNK在干预组表达较模型组明显下调。结论1、胆胰管内注射2%TNBS乙醇PBS溶液的方法成功复制慢性胰腺炎的动物模型。2、本方法可反映急性胰腺炎向慢性胰腺炎转化的动态过程,符合人类慢性胰腺炎病情演变的规律。本方法造模后4周,即可满足研究需要。3、激活素、整合素、内皮素可促进慢性胰腺炎发生纤维化过程。4、激活素促慢性胰腺炎胰腺纤维化的作用主要发生在病程的后期,整合素、内皮素促慢性胰腺炎胰腺纤维化的作用主要发生在病程的早、中期。5、汉丹肝乐具有抑制大鼠慢性胰腺炎胰腺纤维化的作用。6、JNK信号传导通路在慢性胰腺炎胰腺纤维化发生过程中起重要作用。7、内皮素、整合素、激活素对PSC的活化、增殖作用可能与JNK信号传导通路的活化有关。8、汉丹肝乐对胰腺纤维化的干预与其减少内皮素、整合素、激活素的生成、抑制JNK信号传导通路的活化有关。