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褪黑激素(Melatonin,Mel)是主要由松果体和视网膜分泌的具有多种生物活性的激素,广泛分布于多个组织中。它的分泌主要受光照时间和光照周期的影响,它与褪黑激素受体结合通过下丘脑—垂体—性腺轴从各个水平调节动物昼夜节律和繁殖功能。本研究旨在从分子水平研究鸡MTNR1B和MTNR1C基因5调控区的多态性以及不同时期卵巢中的表达差异,并验证MTNR1B基因不同单倍型启动活性的差异。 本实验以寿光鸡、文昌鸡为研究材料,对鸡MTNR1B和MTNR1C基因5调控区进行PCR扩增,用单克隆测序得到MTNR1C基因外显子1后的gap序列以及MTNR1B和MTNR1C基因可能的SNPs位点,采用直接测序的方法检测每只寿光鸡的SNPs,并将其与产蛋性状进行关联分析,对产蛋性状有影响位点构建单倍型检测其双荧光素酶活性,检测MTNR1B和MTNR1C基因在不同时期卵巢中的表达情况,结果表明: (1)MTNR1B基因的5调控区存在13个SNPs位点,-836、-778和-629位点完全连锁,对26~45周龄产蛋数、46~50周龄产蛋数和总产蛋数有极显著影响(P<0.01)。群内共有CGA、TAG两种单倍型,单倍型CGA在前期、中期、后期产蛋数和50周龄总产蛋数上显著高于TAG,加性效应值分别为1.0枚、2.7枚、1.2枚和4.9枚。在中期、后期和50周龄总产蛋数上,两种单倍型存在极显著的互作,显性效应值分别达到了3.0枚、2.0枚和5.6枚。单倍型CGA比单倍型TAG开产日龄提前1.0d,有使开产日龄提前的趋势,但影响不显著(P>0.05)。 (2)MTNR1C基因的5调控区存在8个SNPs位点和2处碱基插入缺失位点,-637、-597、-219、-142位点对开产日龄、20~25周龄产蛋数和总产蛋数有显著影响(P<0.05)。-637位点等位基因C比T使鸡开产早3.5d,前期产蛋数多2.4枚,总产蛋数多4.5枚,-597位点等位基因T比C使鸡开产早3.7d,前期产蛋数多2.6枚,总产蛋数多5.0枚,差异极显著(P<0.01);-219位点等位基因A比G使鸡开产提前3d,差异显著(P<0.05),前期产蛋数增加2.4枚,总产蛋数增加4.8枚,差异极显著。-142位点和-219位点完全连锁,对产蛋性状的影响与-219位点是完全一致的。单倍型CTAA与TCGC相比,开产日龄提前3.4d,前期产蛋数多2.7枚,总产蛋数多4.1枚,差异显著,各位点之间没有明显的互作效应。-553和-549间的碱基插入缺失位点使开产日龄显著提前4.1d,前期产蛋数显著增加2.7枚,但是后期产蛋数显著减少2.3枚。 (3) MTNR1B和MTNR1C基因多态位点交互作用分析发现-836、-778、-629连锁位点和-219、-142连锁位点在鸡的开产日龄上存在交互效应(P<0.05)。合并基因型分析发现,基因型CCGGAAAAAA开产最早为154.6d,前期、中期、后期产蛋数和总产蛋数最多。 (4)-836、-778、-629位点构建三种单倍型,转染到体外培养的鸡卵泡膜细胞中验证其启动活性差异。双荧光素酶检测结果表明,TAG启动活性显著高于CGA、TGG。 (5) MTNR1B和MTNR1C基因在不同时期卵巢中的表达情况,以140d开产母鸡为对照,发现MTNR1B在42d未开产时表达量最高,显著高于其他时期,MTNR1C在各个时期表达差异不显著。140d开产母鸡MTNR1B和MTNR1C的表达比106d未开产母鸡下调,140d未开产母鸡MTNR1B和MTNR1C表达也高于140d开产母鸡,但是差异均不显著。 本研究发现一些潜在的分子标记,为鸡的遗传选育改良及褪黑激素受体调控鸡繁殖性能的分子机制提供参考。