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研究背景牙周炎是发生在牙周支持组织的慢性感染性疾病,是造成成人牙齿丧失的主要原因,并对人全身健康造成重要影响。国际临床调查结果显示,绝大多数成年人都患有轻中度牙周炎,其中,高达15%的成年人患有重度牙周炎。2003年WHO组织将恶性肿瘤、心血管疾病、牙周炎并列为危害人类健康、需要重点防治的“三大疾病”。由此可见,牙周炎是国际医药卫生系统面临的重要疾病,然而牙周炎治疗目前临床缺乏有效应对措施,牙周缺损的修复更是目前国际关注的难题。现阶段临床常用的治疗方法比如龈下刮治、根面平整和牙周翻瓣等治疗方法可以有效去除致病因子、控制进展性炎症以及促进组织修复。90年代用于牙周治疗的其他方法如牙周骨移植(bone grafting)、引导组织/骨再生技术(guided tissue/bone regeneration,GTR/GBR),虽然给牙周炎治疗带来新的思路和方法,也在一些特定条件下,获得了不同程度的牙周组织再生,但是这些治疗方法都无法真正意义上重建破坏的牙齿支持结构(如牙槽骨-牙周膜-牙骨质结构),使其恢复正常组织结构并正常行使生理性功能。近20年来,干细胞和再生医学研究取得重要进展,利用再生医学的原理、干细胞技术等促进牙周再生也成为一个崭新的研究领域。已有大量的基础和动物体内研究将干细胞(例如骨髓和牙周膜组织来源的干细胞)与基质材料(支架)结合促进牙周支持结构再生,并取得重要研究进展。研究证实,来源于牙周膜的干细胞(periodontal ligament-derived stem cells,PDLSCs)是牙周组织自我修复的主体细胞。一些临床前期试验和小规模临床观察结果提示,PDLSCs用于治疗牙周支持组织破坏,具有传统治疗无法达到的优势。然而,干细胞治疗修复牙周缺损的安全性和有效性,目前尚缺少真正的临床对照试验证实。干细胞治疗为牙周炎的治疗和牙周组织缺损修复带来了新希望。然而,目前临床前期治疗方案中关于干细胞数量及移植模式等仍缺乏最佳标准,其中最简单易行的方法是细胞悬液注射。可是这种方式细胞存活率低、容易产生不良反应,因此多数细胞治疗均采用细胞膜片的方式。细胞膜片工程技术的快速发展使这种无支架细胞植入方法成为细胞治疗的常用手段之一。细胞膜片是细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的聚合体,既保存了细胞生长的微环境,又维持了细胞的生物学性能、细胞间连接以及细胞基质,大大提高了细胞移植的成活率。因此,本课题设计一个单中心、前瞻性、连续性随机临床对照试验研究,初步评估应用自体PDLSC膜片复合目前临床常用的骨材料(Bio-Oss~?)治疗牙周骨下袋缺损的安全性和有效性。由于现阶段还处在干细胞牙周治疗的初级阶段,本试验的主要目的是评价干细胞用于牙科领域的安全性。自体PDLSCs来源于患者自体牙周膜组织,由于牙周炎的患者多为中老年人,所以在完成临床试验期间,我们对来源于42个个体的62颗牙齿来源的干细胞,按照年龄进行分组,对比分析不同年龄组个体来源的PDLSCs及其细胞膜片的生物学特征和再生潜能,探索年龄因素对PDLSCs及其细胞膜片的影响,为进一步大样本、多中心临床试验的开展提供参考和借鉴。方法1.制定符合临床试验的自体牙周膜干细胞膜片制备和运送流程:拔除患者无保留价值的牙齿,运送到具有临床细胞培养资格的实验室,从牙根表面中1/3分离残留牙周膜组织,按照制定的标准程序,分离、纯化、培养PDLSCs并制备PDLSC膜片,按照规定流程和条件,运送至临床试验管理护士,备用。2.制定《自体牙周膜干细胞复合煅烧骨修复牙周炎所致骨下袋牙周缺损的临床研究》临床研究方案,通过第四军医大学口腔医院临床试验伦理委员会审查。根据纳入和排除标准,纳入患者按照牙齿随机分组原则分为对照组(GTR手术配合Bio-oss骨粉植入)和细胞组(GTR手术配合PDLSC膜片+Bio-oss骨粉植入),历经12个月的随访,根据不良事件发生的频率和程度评价干细胞牙周治疗的安全性,根据牙周手术后3个月、6个月和12个月骨再生情况及其相关临床指标评价有效性。3.收集临床因阻生、无无功能等原因拔除的第三磨牙,根据供体年龄,将牙齿分为A(18-30岁)、B(31-45岁)、C(46-62岁)三组,按照临床试验标准,分离培养PDLSCs。在细胞水平,通过CFU-F测定、MTT实验、流式细胞仪检测、细胞成骨、成脂分化能力、衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-βG)染色、细胞多能性相关转录因子的表达等方法评估不同年龄组PDLSCs的生物学活性。在细胞膜片水平,通过细胞膜片形态表征、ALP活性测定、蛋白形成能力和成骨基因表达分析等方法,评估细胞膜片再生潜能。本实验不仅为临床试验结果的分析、评价提供细胞层面的参考,也为进一步设计大规模、多中心同类试验提供重要数据资料。结果1.临床试验中心提供的24颗牙齿,除2颗没能正常获得可供膜片制备的PDLSCs外,其余牙齿均获得满足临床使用要求的细胞膜片。膜片制备、转运过程中,无意外或影响细胞安全的事件发生。2.本实验共有30位牙周炎患者、48颗骨下袋缺损的牙齿符合纳入和排除标准,年龄分布从18至65岁。48颗牙齿随机分成对照组和细胞组,排除骨缺损不合要求、细胞培养失败等原因,最后对照组21颗牙齿成功接受GTR+Bio-oss骨粉植入治疗,实验组20颗牙齿成功接受GTR+PDLSC膜片+Bio-oss骨粉植入治疗。随访期间,安全性评估未发现因PDLSCs植入引起的任何不良事件。有效性评估结果显示,两组患牙治疗后3月、6月和12月,牙槽骨的高度在骨下袋缺损处均有明显增加,且随时间延长,骨缺损面积缩小,有统计学差异(P<0.001)。但对照组和细胞组两组间比较,差异并无统计学意义(P(29)0.05)。3.从不同年龄组供体获得的PDLSCs,增殖潜能、成骨分化潜能以及多能性相关转录因子的表达均随年龄增加而呈现降低的趋势。此外,SA-βG染色结果显示PDLSCs随着年龄增加,细胞SA-βG阳性率增加。通过电镜扫描和Ki-67免疫组化染色显示,年老PDLSCs形成细胞膜片的能力较年轻PDLSCs减弱。根据细胞膜片ECM蛋白含量(包括纤连蛋白、整联蛋白β1和COL-I)和ALP活性测定,成骨相关基因检测(ALP、Runx2和骨钙素)等实验发现,来源于老年PDLSCs的细胞膜片的成骨潜能弱于年轻组PDLSCs诱导的细胞膜片。结论1.从临床拔除患牙中获取人PDLSCs,方法可靠、技术成熟。本实验建立的临床人PDLSC膜片的制备和转运标准可以在同类试验中推广。2.自体PDLSCs治疗牙周炎所致骨下袋缺损,切实可行、安全可靠。虽然本试验结果并没有显示细胞治疗组获得更多的牙周组织再生,但病例数少、年龄因素对细胞膜片再生潜能的差异、细胞载体材料Bio-Oss的细胞相容性问题,可能对本试验的结果会产生干扰。自体PDLSCs治疗牙周炎所致骨下袋缺损的有效性需要进一步多中心、大规模的随机对照临床试验来验证。3.年龄因素对自体PDLSCs和自体PDLSC膜片的生物学性能产生重要影响,进一步类似临床试验设计中,必需加以考虑。4.口腔疾病防治领域是转化医学的沃土,病员丰富、临床需求广泛。牙周病防治是一个严峻的社会问题,在发展中国家尤为突出;迄今为止,临床上缺乏有效的防治措施。如何尽早引入转化医学理念,立足临床疾病治疗,将实验室新发现、新成果转化并用于疾病治疗,是牙周炎诊疗水平全面整体提升的关键举措。