背景KRAS基因位于12号染色体上,是表皮生长因子受体(EGFR)功能信号的下游分子,在膜受体到腺苷环化酶信号转导中起重要作用。大约30%的人类肿瘤细胞中出现RAS基因突变,其中KRAS基因对人类癌症影响最大。KRAS基因与一些肿瘤的发病机理和预后相关,主要以结直肠癌、肺癌和胰腺癌的突变率比较高。KRAS基因突变发生在肿瘤恶变的早期,并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致。一般认为,KRAS基因状态不会因治疗而发生变化。KRAS基因最常见的突变方式为点突变,研究表明,90%的KRAS基因突变位于2号外显子的第12和13密码子位点,其中三种常见的突变类型是GGT>GAT (G12D)、 GGT>GTT(G12V)、GGC>GAC(G13D)。在肺癌中以肺腺癌为主,突变率为20%-30%,结直肠癌患者突变率为27%-43%。BRAF基因位于人染色体7q34,长约190kb,是Ras-Raf-MEK-ERK信号转导通路重要的转导因子,主要通过有丝蛋白激酶通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶来发挥作用,该酶将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接,启动多种因子参与调控细胞内多种生物学事件,如细胞生长、分化和凋亡等。研究发现约15%的结肠癌中存在体细胞BRAF基因错义突变,绝大多数(约89%)的突变发生在15外显子,其中约92%位于第1799核苷酸上,T突变为A (T1799A)。BRAF在结直肠癌的高、中、低分化中表达的阳性率差异明显,肿瘤分化程度越低,BRAF阳性表达率越高,可为结直肠癌的诊断、治疗提供新的依据。目前,结直肠癌和肺癌的治疗仍以手术治疗为主,辅助以化学药物治疗、放射治疗。但是,随着肿瘤分子生物学、基因组学的不断发展,肿瘤靶向治疗预测指标及分子靶向治疗药物受到了越来越多的重视,并被逐渐应用到临床治疗当中。近些年来,结直肠癌和肺癌的治疗领域中最大亮点是确定KRAS基因和BRAF基因状态与抗EGFR抗体疗效的相关性。最新的研究显示,靶向治疗药物西妥昔单抗治疗的有效性受KRAS基因和BRAF基因状态的影响,突变型的KRAS基因和BRAF基因无需EGFR接收信号能够自动活化该通路并启动下游信号的转导,因此只有野生型KRAS和BRAF基因的患者才能从抗EGFR的治疗中获益,而突变型的患者则不能。因此,美国国立综合癌症网络(NCCN)推荐在使用抗EGFR单克隆抗体进行治疗之前,先对患者进行KRAS和BRAF基因突变检测。对于存在KRAS和BRAF突变的患者,不推荐使用抗EGFR单克隆抗体进行治疗。目前,国内外检测基因突变的方法很多,如PCR产物直接测序法、Taqman探针法、单链构象多态性分析法、限制性片段长度多态性分析方法、焦磷酸测序方法、变性高效液相色谱法、突变特异性扩增系统等。这些方法存在着成本高、操作复杂或灵敏度低等问题,不利于临床大样本检测。目前全球缺乏基因突变检测的标准化规范,因此,寻找和建立一个低成本、高通量、简便易行、准确可靠的检测方法,推广到临床应用,是一个亟待解决的问题。高分辨率熔解曲线分析法(high resolution melting, HRM)是在实时荧光定量PCR基础上通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化进行分析的一种新兴分子诊断技术。HRM检测无需使用序列特异性探针,不受突变碱基位点和种类的局限,具有高灵敏度、高特异性、操作简便、低成本、高通量、闭管操作等优点,可检测石蜡包埋组织块、血液、粪便等多种来源标本。HRM技术不损伤DNA,分析之后可以直接纯化测序,可应用于基因分型、突变扫描等多方面。因此,如果能建立此技术在临床结直肠癌和肺癌KRAS和BRAF基因诊断的可行性,对指导临床个体化治疗和降低患者的经济负担具有重要意义。目的本研究旨在利用当前的实时荧光定量PCR仪,结合饱和荧光染料和HRM分析软件,构建HRM法检测结直肠癌和肺癌KRAS和BRAF基因突变的方法,并初步应用于临床。通过检测条件的优化,做到对KRAS和BRAF基因进行灵敏、特异、实时简便、快速准确的突变检测,并通过与直接测序法和ARMS(?)去的方法学比较,分析此方法在检测基因突变方面的优势和在临床上应用的可行性。统计分析标本参数与HRM检测KRAS基因突变结果的相关性。方法1.HRM检测技术参数优化用已知KRAS和BRAF基因突变类型的HT29人结肠癌细胞系、SW480人结肠癌细胞系和MDA-MB-231人乳腺癌细胞系DNA做PCR扩增模板,采用温度梯度PCR和正交设计实验优化qPCR-HRM反应体系和反应条件。梯度稀释HT29细胞DNA,进行PCR扩增,以循环数Ct值为纵坐标,梯度稀释的不同浓度起始DNA对数值为横坐标,绘制标准曲线。将KRAS基因突变型DNA(SW480)和野生型DNA(HT29)梯度混合稀释,突变型DNA浓度分别为100%、50%、25%、12.5%、6%、3%、1%,进行qPCR-HRM反应,并将扩增产物进行直接测序,比较两种方法的灵敏度。2.结直肠癌和肺癌临床标本的KRAS、BRAF突变检测收集在广州军区广州总医院进行手术治疗的结直肠癌和非小细胞肺癌(NSCLC)患者石蜡包埋组织标本128例,其中结直肠癌和NSCLC标本各64例,进行HE染色并提取石蜡包埋组织DNA,检测DNA浓度并将浓度统一调整至30ng/μl,按照优化的qPCR-HRM反应条件进行KRAS和BRAF基因突变检测,同时进行直接测序验证,比较两种方法的一致性和检测结果差异。ARMS方法检测4例结直肠癌标本KRAS基因突变,和HRM法、测序法比较结果。将结直肠癌中⑶例KRAS突变型和1例KRAS野生型同时重复检测15次,选取结直肠癌5例KRAS突变型和5例KRAS野生型标本,每隔30天检测一次,共检测3次,观察HRM方法的重复性。将KRAS基因突变型DNA(标本C32)依次稀释至30ng/μl、20ng/μl、10ng/μl、5ng/μl、2.5ng/μl和1.0ng/μl,进行HRM检测,分析最低检测模板量。观察HE染色片,统计分析标本中肿瘤细胞数量、淋巴细胞数量和胞外黏液素与突变检出结果之间的相关性。统计分析肿瘤分期、淋巴结转移和远端转移因素与突变检出结果的相关性。采用SPSS13.0统计软件进行数据处理分析,组间检出率的比较采用卡方检验,多因素与突变检出结果的相关性分析采用logistic回归分析,选取检验水准a=0.05。结果1.温度梯度PCR和正交实验结果显示：KRAS基因的qPCR最佳退火温度为58℃,20μl反应体系中最佳反应体系为：引物浓度为0.5μmol/L,Mg2+为2.5mmol/L,模板DNA为40ng。BRAF基因的qPCR最佳退火温度为55℃。qPCR标准曲线相关系数R2为0.99928,拟合满意,扩增效率为1.05,扩增效率高。HRM法的最低检出限为1%,即突变型DNA比例只有1%时,能检测出突变。直接测序法是当突变型DNA浓度为25%及以上方能检测出突变,提示HRM方法比直接测序法灵敏度高。2.HRM法共检测出23例结直肠癌和9例NSCLC标本为KRAS基因突变型,4例结直肠癌标本为BRAF基因突变型,其余均为野生型。所有突变标本均为KRAS或BRAF基因单一突变,无同时突变。经直接测序,确认HRM法检测为KRAS突变型的23例结直肠癌标本和7例NSCLC标本发生了KRAS基因第2外显子突变；2例NSCLC标本HRM法检测为突变型,但测序结果为野生型。测序法与HRM法检测结果比较,P=0.500(P>0.05),两法检出率差异无统计学意义,还不能认为两种方法的检测结果不同,κ=0.957(K>0.7),说明两种方法的吻合度有统计学意义且较强。此次实验HRM方法的灵敏度为100%,特异度为98%。ARMS法检测4例标本KRAS基因突变结果和HRM法、测序法结果完全一致。HRM重复性检测结果为15份C16为KRAS野生型,15份C32为KRAS突变型,批内重复性好,3次不同时间分别对10例结直肠癌样本KRAS基因进行HRM检测,结果显示5例野生型和5例突变型检测结果一致,批间重复性好。DNA模板浓度为1.0ng/μl时,熔解曲线和野生标准品熔解曲线无明显差异,其余模板浓度的熔解曲线和野生标准品熔解曲线差异明显,提示HRM方法DNA模板量最低可达2.5ng。统计分析128例肿瘤标本参数与HRM检测KRAS基因突变检出率的相关性,x2检验结果为肿瘤细胞数量≤30%和>30%两组间突变检出率有统计学意义(P=0.031),淋巴细胞浸润比例≤10%和>10%两组间突变检出率有统计学意义(P=0.025)。logistic回归分析结果说明肿瘤细胞数量、淋巴细胞数量和胞外黏液素因素与KRAS基因突变检出率有显著性关系(P<0.05)。肿瘤分期、淋巴结转移和远端转移参数组间均无统计学意义。结论1.HRM方法检测基因突变的检出限可达1%,直接测序法若突变型等位基因比例低于20%时即难以确定是否存在突变,HRM法比直接测序法灵敏度高。优化的qPCR-HRM反应条件扩增效率高,特异性好。2.直接测序法和HRM法检测结果一致性高,验证了HRM法的准确性。ARMS法再次验证了HRM法的准确性,但ARMS法成本高,不适合常规检测。HRM法的重复性好,不随样品存放时间而改变。HRM法DNA模板量最低可达2.5ng,只需要微量的DNA样品即可检测出突变。肿瘤石蜡包埋组织标本的肿瘤细胞、淋巴细胞和胞外黏液素是基因突变检出率的影响因素,提示标本的取材和质量很重要。HRM方法不受突变碱基位点和种类的局限,高灵敏度特异性、操作简便、高通量、低成本、准确可靠,可应用于临床基因突变检测。