前言:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率有逐年增加的趋势，目前缺乏有效的治疗方法，如何改善肺癌的治疗状况、提高肺癌患者总的生存率是函待解决的重要问题。在肺癌的综合治疗中，化疗是最基本的治疗方法，也是不可缺少的重要手段。以顺铂等铂类药物为基础的联合化疗明显改善了晚期肺癌患者的治疗效果，成为肺癌治疗史上一座新的里程碑，但其毒副作用较大且易产生耐药性，严重影响其化疗效果。P-gp是mdr1基因编码的ABC家族的一种ATP结合膜蛋白，利用水解ATP释放的能量，逆浓度梯度将药物主动运输到细胞外，导致药物在细胞内蓄积减少而产生耐药。livin是一种新的抗凋亡基因，有学者发现livin是参与肺癌对放疗、化疗耐受的重要因素，在肺癌药物化疗后livin在肺癌组织中表达明显增强。非甾体抗炎药吲哚美辛(indometacin，In)是较强的前列腺素合成酶抑制剂之一，它具有一定抗肿瘤作用，近年来有些学者发现IN与化疗药物合用，能增强化疗药物对耐药肿瘤细胞的毒性作用。本研究应用IN和DDP联合干预A549/DDP细胞，观察其对A549/DDP细胞增殖、凋亡、P-gp蛋白，Livin蛋白表达的影响，探讨其逆转A549/DDP细胞耐药的机制。　　 材料与方法:　　 1、A549、A549/DDP细胞的培养A549和A549/DDP两株细胞培养在含10％新生小牛血清、含青链霉素各100u.mL-1的DMEM高糖培养液中，37℃，95％湿度，5％CO2条件下培养，0.25％胰蛋白酶消化传代，每天换液一次，每2-3天传一次代。A549/DDP的培养基中加入3μgml-1的顺铂以维持其耐药性。　　 2、裸鼠A549/DDP移植瘤模型的制作当A549/DDP细胞进入对数生长期后，采用不含DDP的培养液继续传代两次后，消化、收集对数生长期细胞，细胞计数，调节细胞浓度为7-8x106/ml。常规消毒裸鼠右前肢腋下皮肤，每只裸鼠皮下注射0.1ml细胞悬液，细胞数7x106，裸鼠接种后待肿瘤最长径达1.0cm左右，取28只裸鼠随机分为4组。实验分组为对照组，1.5mgIN组、3.0mgIN组、2.0μgml-1DDP组。　　 3、噻唑蓝比色法测定(MTT)用MTT法检测IN对A549及A549/DDP细胞作用24h、48h、72h的细胞毒作用，测定IN作用A549/DDP48h无细胞毒性浓度，测定A549/DDP对DDP耐药倍数；用顺铂分别处理A549、A549/DDP细胞48h，MTT法检测抑制效应，并求出A549/DDP对DDP耐药倍数；、MTT法检测无细胞毒性浓度IN与顺铂联用对A549/DDP的抑制效应，求出IN对A549/D DP耐药逆转倍数。　　 4、免疫细胞化学法细胞系经固定、封闭后，与Livin抗体孵育过夜。随后滴加二抗，DAB显色，苏木素轻度复染核。　　 5、FCM Annexin V/FITC、PI双染法对数生长期细胞，以1.25×105/mL密度接种于培养瓶中，24 h后，分成4组，空白对照组、DDP组、IN组、IN+DDP组，干预48h后收集所有细胞，根据AnnexinVFITC/PI试剂盒说明，流式细胞仪检测A549/DDP细胞凋亡。　　 6、Hoechsot33258染色法检测IN+DDP诱导凋亡A549/DDP细胞IN+DDP干预48h后固定，加入0.2mlHoechst33258染色液，荧光显微镜激发波长350nm发射波长460nm下检测凋亡细胞。　　 7、JC-1线粒体跨膜电位检测将对数生长期的A549/DDP细胞，每孔2ml细胞悬液(5×105个细胞)，分为3组DDP、IN+DDP、空白对照组处理细胞，继续培养，于48h收集细胞，取500μLJC-1工作液将细胞沉淀均匀悬浮，用流式细胞仪分析。　　 8、caspase3活性检测将对数生长期的A549/DDP细胞，接种到6孔板中，每孔2ml细胞悬液(5×105个细胞)，分为3组DDP、IN+DDP、空白对照组处理细胞，于48h收集细胞，裂解细胞，提取蛋白加入检测试剂，用酶联反应仪测定A405波长。　　 9、Western Blot与RT-PCR应用Western Blot与RT-PCR检测应用IN干预A549/DDP细胞后，检测mdr1、livin基因、P-gp蛋白、Livin蛋白的表达情况。　　 10、SPECT、体外检测A549/DDP对99Tcm-MIBI摄取情况评价逆转效率A549/DDP细胞及裸鼠移植瘤在DDP联合应用IN的情况下，细胞及肿瘤组织对99Tcm-MIBI摄取率的改变情况，评价P-gp蛋白的功能。　　 11、统计分析各组资料利用SPSS for window13.0进行统计分析。P<0.05有统计学意义。　　 结果:　　 1、MTT比色法结果玳可明显抑制体外培养的A549株和A549/DDP株细胞的增殖，且抑制程度随IN作用时间和浓度的增加而增加，呈一定的时间、剂量(20μmol l-1-800μmol l-1)依赖性，表明IN本身有细胞毒性作用，能抑制肺腺癌细胞的增殖；低于或等于100μmol1-1IN作用48h对A549/DDP细胞无明显毒性(IR<10％)，将100μmol l-1确定为IN的无细胞毒性浓度。A549细胞的IC50为1.344μg/ml，A549/DDP细胞的IC50为15.91μg/ml，A549/DDP耐药倍数为11.84倍；无细胞毒浓度100μmol l-1IN与DDP合用时，A549DDP细胞的IC50降为5.96μg/ml，逆转倍数为2.67，说明IN增强了DDP对A549/DDP株细胞的杀伤作用，即与DDP合用时，能恢复DDP对A549/DDP细胞的敏感性，表明IN具有化疗增敏作用。　　 2、免疫细胞化学法结果Livin在A549/DDP细胞系中呈强阳性表达，定位于胞浆中，而在A549细胞系中表达较弱，说明Livin于A549/DDP细胞的耐药有关系。证明Livin抗凋亡机制参与了A549/DDP细胞的耐药。　　 3、Hoechst33258染色法结果用形态学手段检测验证了无细胞毒性的IN+DDP能够诱导凋亡，增加了DDP的敏感性。　　 4、FCM AnnexinV/FTTC、PI双染法结果对照组、DDP、吲哚美辛、吲哚美辛联合干预组的细胞早期凋亡率分别为1.91％±0.0172、1.27％±0.0135、3.58％±0.0136、27.9％±0.574，IN+DDP组的细胞早期凋亡与其余三组比较有显著性差异(P<0.001)，吲哚美辛组与其它两组比有差异(P<0.01)，说明IN和DDP联合应用具有增敏诱导耐药细胞凋亡作用。　　 5、JC-1流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位结果IN+DDP组绿色荧光细胞数目占全部细胞的比例为54.64％±0.128，DDP组17.76％±0.078，对照组5.58％±0.016，IN+DDP组与对照组及DDP组比有显著性差异，P<0.05。DDP组与对照组P=0.141>0.05没有差异。证明IN诱导的凋亡是通过线粒体途径。　　 6、Western Blot与RT-PCR结果DDP与IN联合应用后能够抑制MDR1、LivinmRNA的表达，从而抑制相应编码的蛋白的表达。单用DDP组对这两种蛋白表达没有影响。　　 7、caspase3活性检测结果实验结果对照组活性值0.982±0.089，DDP组活性值1.011±0.031，IN+DDP组2.699±0.087，IN+DDP组与对照组、DDP组比较P值<0.01有显著性差异，DDP组与对照组P>0.05无显著性差异。说明IN能够使caspase3激活，发挥其促使细胞凋亡的功能。　　 8、99Tcm-MIBI摄取实验结果A549及A549/DDP细胞对99Tcm-MIBI的摄取率分别为1.269±0.529及0.103±0。36，A549摄取99Tcm-MIBI比A549/DDP细胞高12倍。A549/DDP细胞体外在IN干预下能够增加A549/DDP细胞对99Tcm-MIBI的摄取但仍低于A549细胞，说明IN只能通过抑制P-gp泵出作用部分逆转A549/DDP的耐药。仍有其他耐药机制参与了A549/DDP的耐药。裸鼠移植瘤的99Tcm-MIBISPECT结果显示IN能够增加肿瘤组织99Tcm-MIBI摄取，延缓99Tcm-MIBI的清除为临床评价肿瘤的逆转效果提供了一种新的手段。　　 结论:　　 1、IN对A549/DDP细胞的生长有明显的抑制作用，且随IN浓度及作用时间的增加而增加，生长抑制率呈药物浓度-时间依赖方式。表明IN本身对A549/DDP细胞有增殖抑制作用。　　 2、无细胞毒性浓度低剂量IN能够增强DDP对人肺腺癌细胞耐药株A549/DDP增殖抑制作用，表明IN有部分逆转A549/DDP细胞耐顺铂的作用。　　 3、IN能够抑制抗凋亡因子Livin的表达，诱导耐药A549/DDP细胞凋亡。　　 4、IN能抑制ATP依赖性膜蛋白P-gp的表达减少细胞内DDP的排除，增加药物浓度，增强化疗药物的毒性作用。