蛋白翻译后修饰是细胞中一种重要的蛋白功能调控方式,一直是基础研究中的热点。SUMO化修饰是其中重要的一种,SUMO化修饰包括一系列级联酶促反应,通过E1、E2、E3等酶将SUMO化修饰蛋白连接到底物的赖氨酸上,调控蛋白的亚细胞定位、蛋白之间的相互作用等。我们以SUMO化修饰为主线开展两部分研究,来探索SUMO化修饰对蛋白功能的调控以及在肿瘤发生发展过程中的作用。第一部分:组蛋白H3K36特异甲基转移酶SETD2的SUMO化修饰及调控机制研究SETD2/HYPB是我们课题组之前在CD34+造血干/祖细胞中分离、发现的酵母Set2直系同源基因,并被验证具有组蛋白H3K36甲基转移酶活性,参与调控多种生物学过程,比如转录起始、选择性剪切、同源重组、碱基错配修复、染色质重塑等等。同时,在多种肿瘤中发现SETD2存在基因突变,可能作为肿瘤抑制因子发挥作用。关于SETD2上游调控机制的报道相对较少,最近有研究表明SETD2受到microRNA和长链非编码RNA的调控。我们研究组前期的工作提示SUMO化修饰通路可能参与调控SETD2的功能,本课题通过SUMO化经典位点预测、基因克隆体外表达、免疫共沉淀、细胞转染、免疫印迹等方法我们对SETD2是否发生了SUMO化修饰,是否影响SETD2生物学功能开展了研究。我们通过免疫共沉淀实验发现,SETD2能与SUMO化通路中唯一的E2链接酶UBE2I(Ubc9)发生相互作用;同时与SUMO化通路中重要的E3连接酶PIAS家族蛋白中大部分成员有相互作用。在验证其与SUMO化级联反应的主要连接酶有相互作用的基础上,我们检测到SETD2确实发生了SUMO化修饰,且主要发生SUMO1修饰。通过定点突变实验,我们进一步确定了SETD2的SUMO1修饰位点位于SET酶活结构域的1594位赖氨酸。SENP1是SUMO1修饰底物蛋白的主要去SUMO化蛋白酶,通过免疫共沉淀实验,我们检测到SETD2与SENP1之间具有相互作用。更有意思的是,SENP1过表达可以调控细胞中组蛋白H3K36三甲基化水平,且这种调控依赖于SENP1的去SUMO化酶活作用。这些结果表明,SUMO化修饰通路参与调控SETD2的组蛋白H3K36三甲基化修饰功能。第二部分:MAFB蛋白的SUMO1修饰对人结直肠癌细胞生物学功能的影响及机制研究MAFB是Maf(avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog)转录因子蛋白家族的一员,具有碱性亮氨酸拉链结构域bzip(Basic Leucine Zipper Domain),在器官和组织生长、分化过程中起着重要的调节作用,在多种肿瘤中发现MAFB作为促肿瘤因子起作用。我们通过TCGA数据库在线分析工具cBioPortal对已有肿瘤数据分析发现,MAFB在多数肿瘤中以异常高表达的形式存在,包括结直肠癌。通过对结直肠癌临床标本的MAFB基因表达水平检测和免疫组化分析,发现MAFB在癌组织中表达水平确实显著高于正常组织,且其表达量与肿瘤恶性程度存在一定相关性。在结直肠癌细胞株中对MAFB进行shRNA干扰后发现,S/G2M期细胞显著减少,进一步的研究显示CDK6、CDKN3、CUL1、CUL3等一系列细胞周期相关因子mRNA水平发生显著改变。通过双荧光素酶报告基因检测发现,MAFB可直接调控CDK6的表达。同时,我们发现,与小鼠直系同源基因MafB一致,人源MAFB也存在SUMO化修饰,不同的是,人源MAFB只有一个SUMO1修饰位点,且位于MAFB的32位赖氨酸。通过双荧光素酶报告基因检测发现,MAFB对CDK6的调控作用依赖于MAFB 32位赖氨酸的SUMO1修饰作用。与此一致的是,过表达SUMO1修饰位点突变的MAFB后无法像其野生型一样挽救MAFB敲低的结直肠癌细胞表型。由此,我们推测MAFB可能通过调控CDK6来促进肠癌细胞的增殖作用,且这种调控依赖于其SUMO1修饰。