背景家蝇(Musca Domestic)是人类住所及其附近环境最常见的蝇类,是人类和动物的许多种病原体的传播载体。目前已经发现有100多种引起人类和动物的疾病的病原体与家蝇有关。它们包括霍乱、伤寒、细菌性痢疾、炭疽眼炎、结核、小儿腹泻和寄生蠕虫等。家蝇是公认的危害人类健康的害虫之一。家蝇同时也是法医昆虫学研究的一种重要蝇类。它主要用死亡时间的推断,同时在认定对儿童和老年人的虐待与漠视方面有比较高的价值。家蝇需要温暖的环境生存,在一个合适的温度范围内,环境温度越高其生长率就越高。但是在冬天的时候,家蝇就基本上绝迹,到次年春天温度上升后又大量出现,那么它们是怎么度过寒冷的冬季的呢?研究证实在冬天家蝇大部份都以蛆或者蛹的形态生存过冬。有研究结果提示水通道蛋白Aquaporin(AQP)可能跟昆虫耐低温有关,很可能是昆虫越冬的关键分子之一。AQP属于主要内在蛋白(Major Intrinsic Protein, MIP)超家族成员,在多种昆虫中结构比较保守。以前对昆虫AQP的研究主要集中在它对内分泌的调控和对渗透压的调节这两个方面。但是对于AQP在家蝇中的表达模式和具体功能都尚未见报道。目的1、用分子生物学方法鉴定实验蝇种,为后续实验奠定基础。2、克隆家蝇AQP基因,为其表达模式研究奠定基础。3、筛选家蝇RT-qPCR内参基因,为AQP基因表达模式研究奠定基础。4、研究AQP在家蝇中的表达模式和AQP基因是否具有耐低温的功能。方法1.运用长链PCR方法结合Walking primer克隆家蝇线粒体DNA全序列,利用生物信息学法对家蝇进行分子种属的鉴定。2.运用RT-PCR方法和RACE技术家蝇AQP基因序列全长进行克隆。综合运用多种生物信息学在线软件对AQP基因的核苷酸序列及其推导的氨基酸编码序列进行分析。3.运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件分析在不同实验条件下,家蝇常见内参基因的稳定性,筛选出具体实验条件下稳定的内参基因,然后对实验数据进行标准化。4.运用荧光定量PCR方法检测AQP基因在家蝇成虫的头、胸和腹三部分以及家蝇成虫、卵、幼虫和蛹这四个不同发育阶段转录水平的相对表达量；运用原位杂交技术检测家蝇AQP基因mRNA在内脏中分布情况。5.运用RNA干扰技术沉默家蝇AQP基因的表达,然后通过抗低温实验验证AQP基因是否为家蝇耐低温的关键分子。结果1.家蝇接近mtDNA全长的序列已被其它研究人员抢先上传GenBank数据库(登陆号：EU154477),虽然只有绝大部分的序列,但是距全序列(约15200bp)仅差900bp。因此,我们迅速完成了实验室常规培养的棕尾别麻蝇和蛆症异蚤蝇的mtDNA序列全长测序和拼接等工作,并上传至GeneBank数据库,分别获得登陆号：KF921296和KF974742。这3种苍蝇的mtDNA序列结构组成跟大多数昆虫的mtDNA序列结构组成完全一致：它们的长度都在15000bp左右,包括13种编码蛋白的基因、22种tRNA、2种rRNA和一个非编码的A-T丰富区(通常被认为是控制区域)。生物信息学分析提示mtDNA序列全长能够有效的进行种属鉴定。2.成功克隆出家蝇AQP基因的全长序(GenBank登录号KJ599672),共1210bp,其中开放读码框序列738bp,编码245个氨基酸残基。与报道的其它昆虫的AQP基因序列有较高的保守性。具有6个跨膜结构域和典型的双NPA模序,属于两性通道(amphipathic channel)是主MIP超家族成员。3.经GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件分析发现,在特定的实验条件下,家蝇内参基因稳定性不一,总体上,EF-1和RPS18比较稳定,可以作为本实验条件下的内参基因,对实验数据进行标准化。4.成虫AQP基因从头部到胸部最后到腹部含量越来越高。AQP基因在家蝇的卵、幼虫、蛹和成虫这四个不同的发育阶段都有表达。在蛹晚期表达量最低而卵期最高。成虫的表达量跟早期蛹表达量接近,而高于晚期蛹的表达量。在幼虫阶段,AQP基因的表达量从1龄期到3龄期逐渐下降,直到到蛹期化蝇前达到最低。原位杂交结果显示,AQP基因的mRNA在几乎整个内脏组织中都有表达,但是涎腺最为明显,其分布呈片或条带状,中肠组织也有零星的高表达。比较意外的是常见于其它昆虫表达的马氏管仅呈可疑阳性。5.在对家蝇三龄幼虫进行RNA干扰后的24hr、48hr和72hr,以未注射组相和注射无RNase水组为对照,注射dsRNA组的AQP基因表达水平在48hr和72hr时明显逐渐降低,这说明随着时间延长,dsRNA对家蝇AQP基因的表达起到了很好的的抑制效果。注射无RNase水组跟未注射组的表达量非常接近,这说明无RNase水对AQP基因表达没有明显影响。耐低温实验结果显示,3个处理组中的家蝇三龄幼虫在设定的实验条件下死亡个数很接近。经统计分析,组间差距没有统计学意义。结论1.首次从家蝇中克隆出水通道蛋白基因并首次获得棕尾别麻蝇与蛆症异蚤mtDNA序列全长。2.筛选出具体实验条件下最稳定的可以对实验数据进行标准化的内参基因,本实验中的EF-1和RPS18比较适合。3.首次成功的在家蝇幼虫体内建立了关于AQP基因的RNA干扰体系。4.在我们的实验中尚不能证实AQP基因是家蝇幼虫耐低温的关键分子。