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根据2014年癌症统计,卵巢癌是美国女性第五位致死的病因,全年发病人数21980,但死亡人数却在14270。由于缺乏特异性的腹盆腔症状和敏感标记物使得卵巢癌的早期诊断非常困难,当最终确诊时绝大多数患者都已经进展为晚期。因此,卵巢癌的死亡率居高不下,预后极差,5年预期总生存率往往不到30%。为了早期诊断及改善卵巢癌的预后,非常迫切需要寻找能够辅助早期诊断卵巢癌,并有助于选择最佳的、个性化的治疗方案的肿瘤预测标记物。MicroRNAs (miRNAs)是近年来的研究热点,它是一组短链、非编码的单链RNAs,直接作用于靶向mRNA的非翻译区(Untranslated Regions, UTR)的碱基修复,成为了新的转录后调节器。研究表明,miRNAs参与许多生理过程,譬如细胞循环、代谢作用、血管发生、分化、细胞调亡等。并且miRNAs的异常表达可能与肿瘤有关,其通过调节基因和信号途径参与肿瘤的发生、进展、转移和耐药。最为可喜的是,已有证据表明miRNA在细胞质中产生,不仅可以影响细胞的功能,也可以释放入血液,来发挥调节远处靶基因的功能。与其他循环中的核酸相比,循环中的miRNA水平更加稳定、具有可重复性和持续性。循环中的miRNA在多种实体瘤中被成功评估,可作为新的无创性的疾病早期诊断标记物。在上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer, EOC)中,miR-15a, miR-16, miR-31, miR-200家族等miRNAs表达上调,而let-7,miRNA-34 a/b/c, miRNA-100、miR-199a/214、miR-99a等niRNAs表达下调。其中的miR-99a位于与多种疾病有关的21q21上,研究表明miR-99a在肝细胞癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌以及膀胱癌中均表达异常。已有研究通过miRNA微芯片技术检测,发现miR-99a在正常卵巢组织和卵巢癌中表达存在差异。然而,上皮性卵巢癌中miR-99a是否在血清中异常表达及其在卵巢癌中的生物学功能仍不清楚。因此,有必要验证miR-99a在卵巢癌,特别是上皮性卵巢癌中的作用。在本研究中,我们尝试检测miR-99a在上皮性卵巢癌临床标本和细胞系中的表达,此外,通过体外研究纤维细胞生长因子受体3(Fibroblast growth factor receptor 3, FGFR3),来推测miR-99a在上皮性卵巢癌中的调控机制。第一部分：miR-99a在上皮性卵巢癌患者血清及其卵巢癌组织中的表达研究目的：检测miR-99a在上皮性卵巢癌患者血清、卵巢癌组织及卵巢癌细胞中的表达,探讨miR-99a作为上皮性卵巢癌血清标记物的可能性。研究方法：1.留取15例卵巢癌患者及3例正常志愿者血液样本,采用实时荧光定量PCR检测血清中miR-99a的表达。2.留取手术切除的组织标本,同样的方法检测miR-99a在卵巢癌组织中的表达情况。3.同法检测卵巢癌细胞株SKOV3和正常卵巢组织细胞株OSE中miR-99a的表达。研究结果：1.卵巢癌患者的血清中miR-99a的表达水平下调。2.卵巢癌患者的卵巢癌组织中miR-99a的表达水平下调。3.卵巢癌细胞系中miR-99a表达水平下调。结论：1.miR-99a在EOC中的表达下调,提示miR-99a可能是卵巢癌的一种抑癌基因。2.在卵巢癌患者血清中miR-99a表达下调,有望成为早期诊断上皮性卵巢癌的新的生物学标记物。第二部分：miR-99a靶点基因FGFR3的预测及验证研究目的：通过生物学信息法预测miR-99a调控的靶基因,在卵巢癌细胞中进一步验证miR-99a如何作用于靶基因,从而为进一步阐明卵巢癌发病机制提供理论依据。研究方法：1.使用miRNA靶标预测软件数据库(PicTar、TargetScan、miRanda)寻找初步预测的靶基因,并将初测的基因进行RNA杂交(http://bibiserv. techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/) 。2采用RT-PCR和Western Blot法检测了OSE细胞和SKOV3细胞中FGFR3的mRNA和蛋白表达水平,从而来验证FGFR3基因是否与EOC相关。3.构建FGFR3的3’-UTR区的荧光素酶表达质粒pGL3-FGFR3,与miR-99a共同转染细胞,相对于无处理组(No-treated)和突变组(pGL3-mut),来观察miR-99a对pGL3-FGFR3的荧光素酶活性的影响,进而判断miR-99a是否可直接调控FGFR3的3’-UTR区。4.为了研究miR-99a对FGFR3的表达水平的影响,我们在SKOV3细胞中瞬时转染miR-99a,通过qRT-PCR检测miR-99a转染组细胞中miR-99a的表达水平升高。然后,我们通过RT-PCR、qRT-PCR及Western Blot检测miR-99a过表达对FGFR3的mRNA和蛋白表达水平的影响。进一步验证两者的关系。研究结果：1.通过生物学信息法分析预测FGFR3是miR-99a的靶基因。2.FGFR3在SKOV3细胞中相比OSE细胞的表达水平显著升高。3.miR-99a调控FGFR3的3’-UTR区。4.miR-99a下调FGFR3的mRNA和蛋白表达水平。结论：1FGFR3是miR-99a的靶基因。2.miR-99a可下调卵巢癌细胞中FGFR3的表达。这可能是卵巢癌发生的分子生物学机制之一研究目的：探讨miR-99a对卵巢癌细胞的影响；敲减FGFR3对卵巢癌细胞SKOV3增殖的影响。研究方法：1.采用CCK-8法检测miR-99a过表达对SKOV3细胞增殖的影响。2.采用siRNA技术是将卵巢癌细胞中的FGFR3的表达降低。3.采用CCK-8法检测转染siRNA靶向敲减FGFR3后对SKOV3细胞增殖的影响。研究结果：1miR-99a过表达抑制卵巢癌细胞增殖。2.siRNA有效靶向敲减FGFR3表达后,卵巢癌细胞增殖被显著抑制。结论：miR-99a通过靶向调节FGFR3抑制卵巢癌细胞的细胞增殖。