论文部分内容阅读
目的：白细胞介素4(Interleukin-4，IL-4)能减轻大鼠肝移植后的缺血再灌注及免疫排斥反应，但具体机制仍不清除。信号转导及转录因子6(signal transducers and activators of transcription 6，STAT6)和含十字形结构域蛋白3(Jumonji domain containing 3，JMJD3)在巨噬细胞极化中发挥重要作用。本研究主要探讨Kupffer细胞(KCs)及STAT6-JMJD3信号通路在大鼠肝移植后肝脏缺血再灌注中的作用。
方法：建立大鼠肝移植模型(Liver transplantation，LT)，分为Sham组、LT组、LT+NS组，LT+IL-4组。LT+NS组和LT+IL-4组供体大鼠肝脏在冷存储期间，分别通过门静脉持续微量灌注生理盐水(Normal saline，NS)及溶于生理盐水中的IL-4。术后6小时检测肝功、病理改变、细胞凋亡及炎症的变化情况。分离各组肝移植后肝脏的KCs，流式细胞计数仪、RT-PCR及WesternBlot检测KCs极化及STAT6-JMJD3通路的变化。在体外实验中：分离得到KCs，siRNA敲低KCs中的JMJD3，以及用STAT6抑制剂AS1517499抑制STAT6，再检测IL-4对KCs极化及STAT6-JMJD3通路的影响；IL-4诱导KCs极化后，再用LPS刺激KCs，WesternBlot检测IL-1β、p-p65以探讨JMJD3在IL-4抑制炎症反应中的作用。在大鼠肝移植前给供体大鼠腹腔注射氯磷酸二钠脂质体(Clodronate liposome，CL)或者JMJD3特异性抑制剂GSK-J4，以封闭KCs功能或者抑制JMJD3的功能，术后再检测受体肝功及病理改变。
结果：与Sham组相比，肝移植能明显增加血清中ALT水平(Sham:50.33±8.73IU/L,LT:1836.27±112.30IU/L,n=3,p<0.05)及血清AST水平(Sham:52.17±9.55IU/L,LT:2134.63±137.23IU/L,n=3,p<0.05)，出现出血、坏死等病理改变。而与LT+NS组相比，LT+IL-4组肝移植术后血清中ALT水平(LT+NS:1919.64±127.23IU/L,LT+IL-4:924.18±76.2IU/L,p<0.05)、AST水平(LT+NS:2101.76±179.54IU/L,LT+IL-4:1190±199.12IU/L,P<0.05)明显降低，病理改变减轻，病理组织评分也明显降低(LT+NS:5.5±1.04,LT+IL-4:2.33±0.86,n=3,p<0.05)同时降低了凋亡和炎症反应。IL-4处理也明显增加了M2型KCs的比例为37.12±5.01%，较其他三组明显增加(Sham:2.48±0.69%,LT:3.39±1.20%,LT+NS:3.22±1.11%,n=3,p<0.05)，上调了M2型标记基因Retnla、Arg1的mRNA水平，同时发现p-STAT6和JMJD3的蛋白表达增加，STAT6-JMJD3信号通路被激活。而在体外试验中，与对照组相比，IL-4促进了KCsM2极化，敲低JMJD3后IL-4诱导M2型极化作用均明显受限(IL-4vsIL-4+Si-JMJD3,42.62±2.62%vs12.12±1.23%,n=3,p<0.05)。WesternBlot检测发现敲低JMJD3对STAT6的磷酸化无明显影响(IL-4vsIL-4+si-JMJD3,1.14±0.07vs0.93±0.06,n=3,p>0.05)，但抑制STAT6后，JMJD3的表达也明显受到抑制(IL-4vsIL-4+AS1517499,0.99±0.08vs0.20±0.04,n=3,p<0.05)。在体外实验用LPS刺激KCs，诱导无菌性炎症，发现IL-4能抑制IL-1β和p-p65的表达。敲低JMJD3后，IL-1β和p-p65表达增加，IL-4的抑制炎症作用也明显降低。同时在体内实验中，封闭KCs或者抑制肝脏中的JMJD3，均能使IL-4的保护作用被削弱，血清中ALT升高(LT+IL-4+CLvsLT+IL-4,1483.23±75.09IU/Lvs754.7±73.12IU/L,n=3,p<0.05;LT+IL-4+GSK-J4vsLT+IL-4,1511.73±118.70IU/Lvs754.7±73.12IU/L,n=3,p<0.05)以及AST水平升高(LT+IL-4+CLvsLT+IL-4,1950.26±114.30IU/Lvs966.81±162.12IU/L,n=3,p<0.05;LT+IL-4+GSK-J4vsLT+IL-4,1960.75±102.83IU/Lvs966.81±162.12IU/L,n=3,p<0.05)，病理改变加重，病理评分增加(LT+IL-4+CLvsLT+IL-4,6.03±0.71vs2.52±0.64,n=3,p<0.05;LT+IL-4+GSK-J4vsLT+IL-4,4.25±0.48vs2.52±0.64,n=3p<0.05)。
结论：IL-4通过激活STAT6-JMJD3通路诱导KCs向M2型极化并减轻炎症反应及细胞凋亡，减轻肝移植后缺血再灌注损伤，改善肝功能。
方法：建立大鼠肝移植模型(Liver transplantation，LT)，分为Sham组、LT组、LT+NS组，LT+IL-4组。LT+NS组和LT+IL-4组供体大鼠肝脏在冷存储期间，分别通过门静脉持续微量灌注生理盐水(Normal saline，NS)及溶于生理盐水中的IL-4。术后6小时检测肝功、病理改变、细胞凋亡及炎症的变化情况。分离各组肝移植后肝脏的KCs，流式细胞计数仪、RT-PCR及WesternBlot检测KCs极化及STAT6-JMJD3通路的变化。在体外实验中：分离得到KCs，siRNA敲低KCs中的JMJD3，以及用STAT6抑制剂AS1517499抑制STAT6，再检测IL-4对KCs极化及STAT6-JMJD3通路的影响；IL-4诱导KCs极化后，再用LPS刺激KCs，WesternBlot检测IL-1β、p-p65以探讨JMJD3在IL-4抑制炎症反应中的作用。在大鼠肝移植前给供体大鼠腹腔注射氯磷酸二钠脂质体(Clodronate liposome，CL)或者JMJD3特异性抑制剂GSK-J4，以封闭KCs功能或者抑制JMJD3的功能，术后再检测受体肝功及病理改变。
结果：与Sham组相比，肝移植能明显增加血清中ALT水平(Sham:50.33±8.73IU/L,LT:1836.27±112.30IU/L,n=3,p<0.05)及血清AST水平(Sham:52.17±9.55IU/L,LT:2134.63±137.23IU/L,n=3,p<0.05)，出现出血、坏死等病理改变。而与LT+NS组相比，LT+IL-4组肝移植术后血清中ALT水平(LT+NS:1919.64±127.23IU/L,LT+IL-4:924.18±76.2IU/L,p<0.05)、AST水平(LT+NS:2101.76±179.54IU/L,LT+IL-4:1190±199.12IU/L,P<0.05)明显降低，病理改变减轻，病理组织评分也明显降低(LT+NS:5.5±1.04,LT+IL-4:2.33±0.86,n=3,p<0.05)同时降低了凋亡和炎症反应。IL-4处理也明显增加了M2型KCs的比例为37.12±5.01%，较其他三组明显增加(Sham:2.48±0.69%,LT:3.39±1.20%,LT+NS:3.22±1.11%,n=3,p<0.05)，上调了M2型标记基因Retnla、Arg1的mRNA水平，同时发现p-STAT6和JMJD3的蛋白表达增加，STAT6-JMJD3信号通路被激活。而在体外试验中，与对照组相比，IL-4促进了KCsM2极化，敲低JMJD3后IL-4诱导M2型极化作用均明显受限(IL-4vsIL-4+Si-JMJD3,42.62±2.62%vs12.12±1.23%,n=3,p<0.05)。WesternBlot检测发现敲低JMJD3对STAT6的磷酸化无明显影响(IL-4vsIL-4+si-JMJD3,1.14±0.07vs0.93±0.06,n=3,p>0.05)，但抑制STAT6后，JMJD3的表达也明显受到抑制(IL-4vsIL-4+AS1517499,0.99±0.08vs0.20±0.04,n=3,p<0.05)。在体外实验用LPS刺激KCs，诱导无菌性炎症，发现IL-4能抑制IL-1β和p-p65的表达。敲低JMJD3后，IL-1β和p-p65表达增加，IL-4的抑制炎症作用也明显降低。同时在体内实验中，封闭KCs或者抑制肝脏中的JMJD3，均能使IL-4的保护作用被削弱，血清中ALT升高(LT+IL-4+CLvsLT+IL-4,1483.23±75.09IU/Lvs754.7±73.12IU/L,n=3,p<0.05;LT+IL-4+GSK-J4vsLT+IL-4,1511.73±118.70IU/Lvs754.7±73.12IU/L,n=3,p<0.05)以及AST水平升高(LT+IL-4+CLvsLT+IL-4,1950.26±114.30IU/Lvs966.81±162.12IU/L,n=3,p<0.05;LT+IL-4+GSK-J4vsLT+IL-4,1960.75±102.83IU/Lvs966.81±162.12IU/L,n=3,p<0.05)，病理改变加重，病理评分增加(LT+IL-4+CLvsLT+IL-4,6.03±0.71vs2.52±0.64,n=3,p<0.05;LT+IL-4+GSK-J4vsLT+IL-4,4.25±0.48vs2.52±0.64,n=3p<0.05)。
结论：IL-4通过激活STAT6-JMJD3通路诱导KCs向M2型极化并减轻炎症反应及细胞凋亡，减轻肝移植后缺血再灌注损伤，改善肝功能。