乙醇脱氢酶属于氧化还原酶家族,能够以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)为辅酶,催化伯醇和醛之间的可逆反应。乙醇脱氢酶在很多生理过程中都起着重要作用,参与例如类固醇、类维生素A、脂质过氧化产物、脂肪酸、乙醇等代谢过程。目前,人们已经鉴定了多种生物的乙醇脱氢酶基因,但是家蚕乙醇脱氢酶基因(Bombyx mori alcohol dehydrogenases,BmADH)还未见相关的报道。　　 本研究首先对家蚕乙醇脱氢酶基因BmADH进行了生物信息学分析,并使其在大肠杆菌中表达,通过检测酶活性发现BmADH蛋白活力易受pH、温度影响。为了获得在极端条件下催化活性更高的酶蛋白,本研究借助枯草芽孢杆菌在极端的温度、干燥以及暴露于有机溶剂和其他毒性化学物质等不利条件下能长期存活的性质,首次利用分子生物学方法将家蚕乙醇脱氢酶展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面,获得融合蛋白CotC-BmADH。研究结果如下:　　 1.通过生物信息学方法分析了家蚕BmADH,结果表明,该基因含有5个外显子和4个内含子,开放阅读框全长822 bp,编码274个氨基酸,预测分子量约为29.6 kDa,等电点约为8.21。　　 2.设计引物通过PCR扩增出了家蚕BmADH编码序列,克隆并利用pET-30a表达系统在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,所得融合蛋白通过质谱和Western blotting鉴定为目标蛋白。经Ni-NTA纯化系统纯化后用于免疫新西兰大白兔,制备抗BmADH蛋白的血清。　　 3.使用紫外分光光度计检测经过非变性纯化后的重组家蚕BmADH在不同pH值和温度条件下的酶活力。检测结果表明,BmADH对环境条件敏感,如遇pH值或温度不适则活力明显降低甚至失活。　　 4.将家蚕乙醇脱氢酶基因BmADH与芽孢表面蛋白基因CotC重组,构建融合表达CotC-BmADH韵整合型重组质粒pJS700-BmADH。　　 5.用融合表达BmADH的重组质粒转化Bacillus subtilis168(trp-),得到重组菌株并诱导该菌株的外源蛋白在BmADH的重组芽孢表面展示。使用前期实验制得的BmADH多克隆抗体检测所得蛋白为目的蛋白。　　 6.检测重组CotC-BmADH蛋白和原BmADH的乙醇脱氢酶活力,通过直接比较和统计学分析发现与前者受不同pH、温度影响较小。本实验成功地使原先对温度和pH不稳定的家蚕乙醇脱氢酶展示在芽孢表面,成为可耐受不利环境的CotC-BmADH融合蛋白。