环境雌激素(environmental estrogen)也称为内分泌干扰物(endocrine disrupters或endocrine disruptingchemicals,简称EDCs),是指进入生物体内可通过干扰生物体自身激素的合成、分泌、转运、结合、活性反应、代谢、消解或产生类似生物体自身激素的作用,对生物有机体维护正常的动态平衡、繁殖、生长及行为有不利影响的环境化学物质(生物体外源物质)。环境雌激素除了能通过雌激素受体ERα和ERβ介导胞外信号转导产生雌激素效应外,近来的研究发现,其还可以通过与G蛋白偶联的膜雌激素受体结合激活多个激酶级联反应,产生快速的非基因组效应传导信号。本研究构建了双齿围沙蚕Gα的原核表达系统,获得了纯化蛋白Gα,制备了Gα多克隆抗体,建立了双齿围沙蚕Gα蛋白的间接ELISA检测方法,并在转录水平和蛋白水平检测了不同浓度的双酚A(1μg/L,10μg/L,50μg/L,100μg/L)和苯并(a)芘(0.5μg/L,5μg/L,50μg/L)诱导下双齿围沙蚕Gα表达特征,为研究环境雌激素对双齿围沙蚕毒性作用机制提供更多的依据。具体结果如下:1.利用pET-28a表达质粒和E.coli BL21(DE3),构建了双齿围沙蚕Gα重组蛋白表达系统。诱导表达条件优化显示,1mmol/L IPTG,37℃诱导4h为Gα蛋白表达的最佳条件。SDS-PAGE结果显示重组蛋白Gα以包涵体的形式存在。以8M尿素溶解包涵体,用Ni-NAT柱洗脱得到纯化的重组蛋白Gα,进行多克隆抗体制备,抗体效价为1:512000,Western Blot结果显示Gα多克隆抗体具有良好的特异性。2.不同浓度BPA暴露下,雌性和雄性沙蚕Gαm RNA的表达趋势有所不同。暴露第14d时,100μg/L BPA组对雌性沙蚕体壁Gαm RNA诱导最为明显,表达量达到对照组的6.32倍,与对照组存在极显著差异(P<0.01),而BPA诱导并没有明显上调雌性沙蚕头部Gαm RNA的转录。对于雄性,各浓度组BPA暴露对雄性体壁Gαm RNA的表达并没有显著影响,仅在暴露4d时,100μg/L BPA组的Gαm RNA表达量为对照组的4.65倍;而雄性头部对BPA的诱导较雌性沙蚕头部更为敏感,暴露4d和7d时,50μg/L和100μg/L BPA组Gαm RNA表达量均高于对照组。ELISA结果显示,雌性沙蚕体壁Gα蛋白表达量在各浓度BPA诱导4d、7d和14d时均有所上升,有明显的时间效应关系,其中100μg/L BPA组Gα蛋白表达量在诱导14d时达到最高值,且与对照组有极显著差异(P<0.01);而雌性头部的Gα表达量在暴露4d和7d时并没有明显变化,至第14d,100μg/L BPA组的Gα蛋白表达有显著升高,与对照组存在显著差异(P<0.01)。雄性沙蚕体壁Gα蛋白表达量在诱导4d时达到最高值,第7d和14d的表达量与对照组基本一致;而雄性头部在暴露第4d、7d时,各浓度BPA组的Gα蛋白表达量均上升,且与对照组存在显著差异(P<0.01),到第14d时表达量降到与对照组基本一致的水平。3.不同浓度B(a)P暴露下,雌性沙蚕体壁Gαm RNA并没有显著的上调作用;对于雌性沙蚕头部,在暴露的第7d时,50μg/L B(a)P组的Gαm RNA表达量仅为对照组的50%,而暴露4d和14d时,各浓度组的基因表达量并没有明显变化。在暴露初期(4d),B(a)P对雄性沙蚕体壁有显著的抑制作用,Gαm RNA表达量仅为对照组的26%、27%和30%,至7d和14d时,各组表达量上升到与空白对照组相当的水平,雄性头部Gα的基因变化趋势与体壁基本一致。ELISA结果显示,雌性体壁的Gα蛋白在暴露第7d时表达最明显,表达量均高于对照组且存在显著差异(P<0.05);雌性沙蚕头部,暴露4d时,5μg/L浓度组的蛋白表达量达到最高值且存在显著差异(P<0.01)。雄性沙蚕体壁Gα蛋白表达随着B(a)P暴露时间的延长而逐渐升高,有明显的时间效应关系,其中暴露第4d蛋白表达量均低于对照组,暴露第14d时,各组蛋白表达量均高于对照组且差异显著(P<0.01);雄性头部Gα蛋白表达与体壁的变化规律基本一致,同样也具有明显的时间效应关系。