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随着造纸行业的不断发展,原料短缺、能源紧张、污染严重等问题日益突出,废纸的回收与利用成为了发展的新方向,近些年发展起来酶法脱墨与传统化学脱墨相比,具有节能、环保、针对性强等优点。除常用的脂肪酶外,内切纤维素酶和甾醇酯酶在脱墨中也表现出来较好的性能,如内切纤维素酶能够降低纤维之间聚合度,有利于油墨剥离,甾醇酯酶则能有效的去除胶黏物。但当前,上述两种酶制剂价格偏高,大规模使用存在困难。因此提高内切纤维素酶和甾醇酯酶的表达,降低生产及应用成本具有一定的现实意义。首先,本研究选用了来自于中国草菇内切纤维素酶EG1（GenBank:AF329732）,该酶已在毕赤酵母x33中进行了优化表达并在废纸脱墨中具有极大的应用潜力。本研究从已构建的重组毕赤酵母x33/pPICZαA-EG1中获得目的基因,将其克隆到质粒pPICZαA上,然后利用同尾酶体外构建多拷贝的方法,构建重组质粒pPICZαA-EG1、pPICZαA-EG1（2c）、pPICZαA-EG1（4c）和pPICHKA-EG1（8c）,将重组质粒电转入毕赤酵母感受态中,结合Real-time PCR分析,构建了不同拷贝数重组内切纤维素酶菌株。发酵结果表明,甲醇诱导表达144 h后,两拷贝菌株酶活为24.83 U/mL,在单拷贝的基础上提高了67.20%;四拷贝重组菌株酶活为39.58 U/mL,比二拷贝和单拷贝分别高59.71%和166.55%;更换了表达质粒和菌株后,构建的GS115-pPICHKA-EG1（8C）八拷贝菌株诱导144 h后上清酶活达到了55.65 U/m L,较四拷贝菌株提高了40.59%,比单拷贝菌株高274.75%,。随着拷贝数的提高,酶活增加量在渐渐的降低,因此我们在高拷贝菌株中共表达转录因子HAC1或P180来进一步提高内切纤维素酶EG1的酶活,结果表明,最高表达菌株是八拷贝HAC1过表达菌株,酶活为91.96 U/mL,比单拷贝菌株高519.27%。菌株GS115/pPICHKA-EG1（8c）-HAC1在3 L罐发酵罐中甲醇诱导144 h后,内切纤维素酶的水解酶力为650.07 U/m L,是摇瓶水平的7.07倍,上清中蛋白浓度为4.05 g/L。同时对重组酶EG1的酶学性质进行了检测,最适反应pH和温度分别是5.0和60℃,重组酶EG1在低于60℃的条件下处理60 min后,酶活保持在80.00%以上,在pH5.0-6.0的条件下室温处理24 h后,酶活力还在90.00%以上,同时K+、Mn2+、Ba2+和DTT等金属离子和试剂对重组酶EG1的酶活有一定的促进作用,重组酶EG1针对CMCM底物在pH=5.0和温度60℃条件下,测得的米氏常数为KM=14.29 mg·mL-1,Kcat=4470.37 min-1,最大反应速率是Vmax=0.10μM·min-1·mL-1,催化常数为Kcat/KM=312.85 mL·mg-1·min-1。其次,本研究利用毕赤酵母表达体系成功的构建了甾醇酯酶CHE的重组表达菌株,重组CHE在毕赤酵母中α信号肽的分泌能力高于自身信号肽以及增加分泌短肽,8株常规构建的重组菌株中酶活最高的是x33/pPICZαA-CHE（α）,甲醇诱导120 h后达到了0.38U/m L,比原始链霉菌中培养140 h后的最高酶活0.05 U/mL高666.73%。同时突变菌株（CHE基因的首个氨基酸由丙氨酸突变成了天冬氨酸）x33/pPICZαA-CHE（αT）的酶活为0.95 U/mL,是重组菌x33/pPICZαA-CHE（α）的2.51倍,可能是由于毕赤酵母对天冬氨酸GAU 35.7（2899）的密码子偏好性强于丙氨酸GCU 28.9（2351）,导致该酶的分泌表达提高了。重组酯酶CHE的最适反应温度为50℃,pH是7.0,最适反应底物为对硝基苯酚丁酸酯（4C）,该酶在低于45℃的条件下处理60min,酶活保持在76.78%以上,在pH6.0-8.0的条件下室温处理24 h后,酶活力在80.12%以上,符合造纸用酶对温度和酸碱性的要求。