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第一部分HER4在食管癌中的表达及与转移相关蛋白的关系目的检测HER4在食管癌组织中的表达，探讨其与肿瘤转移相关蛋白MMP-9、VEGF、E-cadherin和CD44v6之间的关系。方法应用免疫组化方法检测45例食管癌组织标本中HER4、MMP—9、VEGF、E-cadherin和CD44v6的表达，采用统计学方法分析HER4阳性表达与后四者阳性表达之间的关系。结果HER4、CD44v6、VEGF、MMP—9和E-cadherin在食管癌组织中的表达阳性率分别为73.3％、68.9％、62.2％、42.2％和22.4％；HER4的阳性表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关(P＜0.01)，而与组织学分级关系无关(P＞0.05)；CD44v6和VEGF的阳性表达亦与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关(P＜0.05)，而与组织学分级无关(P＞0.05)；MMP-9的表达与T分期、TNM分期及淋巴结转移有关(P＜0.05)；E-cadherin的表达与淋巴结转移负相关(P＜0.05)；HER4的阳性表达与MMP-9、CD44v6的表达具有相关性(P＜0.05)，与VEGF的表达显著相关(P＜0.01)。结论HER4、VEGF和CD44v6在食管癌中的阳性表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移有关；MMP-9的表达与T分期、肿瘤TNM分期及淋巴结转移有关；E-cadherin的表达与淋巴结转移负相关；食管癌组织中HER4的阳性表达与MMP-9、VEGF和CD44v6的表达具相关性。第二部分HER4基因siRNA载体的构建及其基因沉默作用目的构建针对人HER4基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体，转染人食管癌细胞Eca-109，观察其基因沉默效果。方法依据siRNA设计原则，设计针对HER4基因序列的四组寡核苷酸链模板，退火后与载体质粒pSUPER/Neo/GFP连接，然后进行酶切鉴定和DNA序列测定。构建质粒用脂质体包裹转染食管癌细胞Eca-109，采用实时荧光定量PCR和Western印迹方法检测HER4 mRNA和蛋白表达情况，从而确定HER4基因被抑制的效果，筛选出有效抑制靶基因表达的质粒。结果经酶切鉴定和DNA测序分析后，提示HER4靶向RNA干扰重组载体构建成功；转染食管癌细胞后，荧光实时定量PCR检测显示，实验组中第2号干扰质粒对靶基因mRNA表达水平抑制作用最明显，mRNA表达水平显著降低(1.19±0.12×10~3)，与空白对照组(3.66±0.31×10~3)相比，具有明显差异(P＜0.05)，HER4的mRNA表达抑制率为67.5％。Western Blot方法检测各组细胞中HER4蛋白表达水平显示，与空白对照组相比，实验组中第2号质粒对靶基因蛋白表达水平抑制作用最明显(P＜0.05)，HER4基因蛋白表达抑制率为56.6％。结论成功构建针对人HER4基因的siRNA表达载体，并可有效抑制食管癌细胞Eca-109中该基因的表达，为下一步实验打下基础。第三部分体外靶向抑制HER4基因对Eca-109细胞MMP—9、VEGF、CD44v6蛋白表达的影响目的了解靶向HER4基因RNA干扰质粒对食管癌细胞株Eca—109中肿瘤转移相关蛋白MMP—9、VEGF和CD44v6表达的影响。方法将Eca-109细胞株分为空白对照组、空白载体组、非特异干扰组和干扰组：空白对照组不予任何处理，空白载体组只加入空白质粒，非特异干扰组加入包含非特异核苷酸序列的质粒，干扰组加入前一部分实验筛选出的最有效干扰质粒进行转染。转染后24、48、72小时应用Western Blot方法检测各组MMP—9、VEGF和CD44v6蛋白表达情况。结果转染后24、48、72小时，干扰组Eca-109中MMP—9和VEGF蛋白表达水平均见明显降低，与空白对照组相比，差异有显著性(P＜0.05)；空白载体组、非特异干扰组与空白对照组相比，差异无显著性(P＞0.05)；转染后48小时，MMP—9和VEGF蛋白表达水平最低，显示RNA干扰效果最明显，表达抑制率分别为56.8％和32.3％。转染后24、48、72小时，干扰组Eca-109中CD44v6蛋白表达水平未见明显降低，与空白对照组相比，差异无显著性(P＞0.05)结论体外食管癌细胞株Eca-109实验表明，靶向HER4基因RNA干扰质粒可以有效抑制细胞中MMP—9和VEGF的表达，提示食管癌中HER4基因与转移相关蛋白MMP—9和VEGF的表达相关，HER4很可能参与这两种蛋白的表达调控过程，进而影响食管癌侵袭转移能力。第四部分靶向抑制HER4基因对食管癌细胞株Eca-109生长和侵袭能力的影响目的观察靶向抑制HER4基因对食管癌细胞株Eca—109生长、凋亡和侵袭能力的影响，探讨可能的相关机制。方法将Eca—109细胞分为实验组、非特异干扰组和正常细胞组：实验组加入前一部分实验筛选出的最有效干扰质粒进行转染，非特异干扰组加入包含非特异核苷酸序列的质粒进行转染，正常细胞组不予任何干预。转染后，采用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT法)检测Eca—109细胞活力，荧光显微镜进行细胞凋亡的形态学检测，Transwell侵袭实验观察细胞侵袭能力变化。结果MTT检测结果显示：Eca—109细胞在转染后48小时后即出现生长能力的下降，至第5天，细胞活力下降约23％，与正常细胞组比较差异有显著性(P＜0.05)，证明针对靶基因的RNA干扰质粒能有效地抑制Eca—109细胞的活力；细胞凋亡形态学检测结果显示：可以观察到实验组细胞发生凋亡的比率要高于非特异干扰组和正常细胞对照组，统计学差异有显著性(P＜0.05)；Transwell侵袭实验结果显示：干扰后48小时，实验组穿膜细胞数明显低于非特异干扰组和正常细胞组，差异有显著性(P＜0.05)，表明RNA干扰后Eca—109细胞侵袭能力下降。结论靶向HER4的RNA干扰质粒可以明显抑制Eca—109食管癌细胞的活力，可以诱导Eca—109食管癌细胞的凋亡，可以抑制Eca—109食管癌细胞的侵袭能力。