脂多糖对腹膜间皮细胞己糖激酶活性的调控及对肿瘤坏死因子表达的影响

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前言 腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是利用腹膜这一半透膜作为滤过膜,通过腹膜毛细血管内血液和腹腔内透析液进行水和溶质的交换,达到清除多余水份和代谢废物的目的,是一体化肾脏替代治疗不可缺少的部分。腹膜透析相关性腹膜炎作为其重要的并发症之一,如果不能很好的控制,最终会引起腹膜透析失败。 腹膜透析相关性腹膜炎引起的腹膜损害就功能而言,主要表现为水清除障碍,即腹膜透析失超滤,又称超滤衰竭(ultrafiltration failure,UF)。UF可分为四种类型(Ⅰ—Ⅳ型)。Ⅰ型为透析液内葡萄糖(glucose,Glc)快速吸收,跨膜渗透压梯度早期消失;Ⅱ型为腹膜通透性与面积乘积值降低;Ⅲ型为腹腔的反超滤较高,跨毛细血管超滤能力处于平均水平;Ⅳ型为腹膜水通道蛋白异常。早期腹膜透析相关性腹膜炎主要表现为Ⅰ型超滤衰竭。本文所研究的己糖激酶和肿瘤坏死因子均参与了UF的病理生理过程。 己糖激酶(hexokinase,HKs)是葡萄糖代谢途径的第一个限速酶。我们以往的研究证明HKs在腹膜间皮细胞(peritoneal mesothelial cells,PMCs)中有较高的活性,并在Ⅰ型超滤衰竭中发挥了重要的作用。那么HKs在腹膜透析相关性腹膜炎中是否扮演了同样的角色呢?本实验即是研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对PMCs中HKs活性的调控及对PMCs葡萄糖净利用的影响,从而阐明腹膜透析相关性腹膜炎引起腹膜透析失超滤的部分机制。 肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)包括肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β。脂多糖是TNF生成的强刺激因素。目前的研究集中于TNFα,并提示TNFα参与了许多病理和生理过程。腹透流出液中的炎症因子如TNFα、IL—1、IL—6等均参与了腹膜透析失超滤的过程。目前的研究提示PMCs能分泌IL—1和IL—6等多种因子,但PMCs能否表达TNF还未见报道。本文从这个角度来阐明腹膜透析相关性腹膜炎对腹膜的损伤作用以及PMCs在其中所发挥的重要作用。实验材料 l细胞) 2 3 4 5实验用细胞:雄性SD大鼠腹膜间皮细胞,四29细胞株(小鼠成纤维细胞培养的相关试剂脂多糖检测己糖激酶活性及Glc含量的相关试剂检测肿瘤坏死因子活性的相关试剂实验方法 1.胰蛋白酶消化法进行大鼠PMCs的原代培养及传代; 2.6一磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法检测HKS活性,观察LPS对HKS活性的调节作用; 3.比色法检测细胞培养液中葡萄糖减少的量,观察PMCs对Gle的净利用力; 4.利用TNF的细胞毒性作用和L929细胞对TNF的特异敏感性检测TNF活性,以明确在LPS作用下,PMCs是否表达TNF,以及LPS对,rNF的调控作用。 5.统计学方法 双因素交互作用分析采用SAS 6.12医用统计软件进行处理。其余数据采用SPss10.o医用统计软件进行处理。各组间差异比较采用单因素方差分析和t检验。P<0.05有统计学意义,即差异有显著性。实验结果 1.在高糖作用下,不同浓度LPS对HKS活性的诱导。(1) IJS浓度与葡萄糖浓度两因素能协同诱导HKs活性(F二423 .55,P<0.以刃1);(2)在LPS作用下,葡萄糖对HKs活性的诱导呈剂量依赖性(F=24.13,P<0.0001);(3)L邢对HKs活性的诱导呈剂量依赖性(F=7.15,P<0.《X刃1)。 2.在高糖作用下,LPS作用不同时间对HKs活性的诱导。(1) LPS的作用时间与葡萄糖浓度两因素能协同诱导HKs活性(F=54.88,P<0.(XX)1);(2)在LPS作用下,葡萄糖对HKs活性的诱导呈剂量依赖性(F=31.63,P<0.0001);(3) IJ邢对于HKs活性的诱导呈时间依赖性(F二5.03,P<0 .01)。 3.LPS对PMCs葡萄糖净利用的影响。(l)与对照组比较江JS组的PMCs对葡萄糖的净利用明显增高(t二5.172,P=0.仪幻);(2) LPS作用不同时间,PMCs对葡萄糖净利用不完全相同(F二83 .125,P二0.000);与1小时比较,LPS刺激6小时后,细胞对葡萄糖的净利用明显增加(P<0.05),并随时间延长,葡萄糖的净利用逐渐增大,24小时对葡萄糖的消耗最大。 4.LpS对HKs活性的诱导与PMCs葡萄糖净利用的关系。二者随时间的变化趋势相似,但线性相关分析提示两者无相关关系(r二O,253,P=0 .682)。 5.LPS诱导PMCs表达TNF(P<0.05)。 6.LPS对PMCs表达TNF的诱导呈时间依赖性。与1小时比,Ll)S作用3小时对TNF的表达的诱导能力是最大的(P<0.01),作用6小时也能明显诱导TNF的表达(P<0.05),3小时后TNF的表达逐渐下降,24小时较3小时和6小时有明显的下降(P<0.05)。讨论 腹膜透析患者由于其全身及腹腔局部的免疫防御机能的下降,极易并发腹膜炎,并且一旦发生腹膜透析相关性腹膜炎,炎症会相对严重且不易控制。因此迄今腹膜透析相关性腹膜炎仍是腹膜透析发病率高,危害性极大的并发症之一。腹膜透析相关性腹膜炎对腹膜的损害很大,其突出的临床表现就是腹膜通透性增加、葡萄糖的吸收加快,导致超滤下降,甚至腹膜透析失超滤。 目前的研究表明葡萄糖的摄取与己糖激酶有关。HKs可将经葡萄糖转运体(glucose transporters,GLUTs)扩散人细胞的Glc磷酸化为6一磷?
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