衣霉素通过下调miRNA-17增强奥沙利铂对口腔癌细胞诱导的凋亡作用

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目的:  以人舌鳞状细胞癌TCA8113、人口腔癌KB细胞为研究对象,探究衣霉素(TM)增强奥沙利铂(Oxa)对其增殖及凋亡的影响及其机制研究。  方法:  1.衣霉素和(或)奥沙利铂处理口腔肿瘤细胞细胞24h、48h、72h后,MTT法检测细胞存活率;  2.衣霉素处理口腔肿瘤细胞:TCA8113、KB细胞24h后,经实时荧光定量PCR技术检测miRNA-17表达水平的影响;  3.衣霉素和(或)奥沙利铂作用于肿瘤细胞,经碘化丙啶(PI)染色后流式细胞仪检测药物对细胞诱导的凋亡影响;  4.药物处理后,经DAPI染色倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡情况;  5.下调口腔肿瘤细胞中miRNA-17的表达观察对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响;  6. Westorn bolt检测细胞内Bax、Bcl-2、Mcl-1、GRP78表达情况。  结果:  1.衣霉素对于口腔肿瘤细胞增殖及凋亡的影响  (1)应用MTT法检测结果发现,衣霉素能够抑制口腔肿瘤细胞TCA8113、KB细胞增殖,并随着药物浓度增加及作用时间延长,抑制作用增强。  (2)衣霉素作用于口腔肿瘤细胞TCA8113、KB细胞后,经PI单染流式细胞仪检测其凋亡率发现,衣霉素对于口腔肿瘤细胞凋亡影响无统计学意义。  2.衣霉素降低口腔肿瘤中miRNA-17的表达水平  衣霉素作用于口腔肿瘤细胞后,经实时荧光定量PCR检测其miRNA-17的表达水平发现,衣霉素能够降低口腔肿瘤中miRNA-17的表达水平。  3.衣霉素与奥沙利铂对于口腔肿瘤细胞增殖及凋亡的影响  (1)衣霉素增强奥沙利铂对于口腔肿瘤细胞增殖抑制作用  应用MTT法检测细胞活力发现,奥沙利铂能够抑制口腔肿瘤细胞TCA8113、KB细胞的增殖,随着药物浓度增加及作用时间延长,抑制作用增加。衣霉素与奥沙利铂合用时能够增强奥沙利铂对于口腔肿瘤细胞的增殖抑制作用。  (2)衣霉素增强奥沙利铂对于口腔肿瘤细胞凋亡率的影响  1μmol/L奥沙利铂作用于KB细胞、TCA8113细胞48h经PI单染流失细胞仪检测凋亡率为24.1%、15.1%;联合用药组凋亡率高于单独用药组分别为46.6%、42.0%。结果显示衣霉素能显著增强奥沙利铂对于口腔肿瘤细胞诱导的凋亡作用。  (3)衣霉素及奥沙利铂对于口腔肿瘤细胞线粒体膜电位的影响  通过JC-1染色后,红绿荧光的变化发现联合用药组-对照组相比,红色荧光呈现出减弱趋势,绿色荧光呈现出增强趋势,提示衣霉素能够增强奥沙利铂对于口腔癌细胞诱导的早期凋亡的发生。  4.衣霉素及miRNA-17的变化对于口腔肿瘤细胞内GRP78的影响  通过Westorn blot检测内质网应激相关蛋白GRP78表达变化,发现衣霉素及下调miRNA-17能够使口腔肿瘤细胞TCA8113、KB细胞发生内质网应激。  5.下调miRNA-17表达增强奥沙利铂对于口腔癌细胞诱导的凋亡作用敏感性  (1)下调miRNA-17后增强奥沙利铂对细胞形态的影响  DAPI染色实验后荧光倒置显微镜观察细胞的凋亡情况。对照组细胞的胞核圆形,均一蓝染,下调miRNA-17与奥沙利铂作用24h后细胞核出现典型的凋亡形态改变,主要表现为核浓缩、细胞核碎裂,说明抑制细胞内miRNA-17表达水平能增强两种口腔肿瘤细胞对奥沙利铂诱导凋亡作用。  (2)下调miRNA-17与奥沙利铂对TCA8113、KB细胞凋亡相关蛋白表达的影响  采用同样药物浓度奥沙利铂作用于口腔癌细胞24h进行Weston bolt检测Bax、Bcl-2、Mcl-1表达,由此可见抑制细胞凋亡的Bcl-2表达水平降低,而促进细胞凋亡的细胞因子 Bax和 Mcl-1的表达水平明显增高,这些细胞因子共同诱导口腔肿瘤细胞启动细胞凋亡,下调miRNA-17表达水平能增强奥沙利铂诱导凋作用的敏感性。  结论:  1.衣霉素抑制口腔肿瘤细胞增殖,对其凋亡影响较小。  2.衣霉素能够增强奥沙利铂对于口腔肿瘤细胞诱导的凋亡作用。  3.衣霉素增强奥沙利铂对口腔肿瘤细胞诱导的凋亡作用敏感性与下调miRNA-17表达有关。
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