论文部分内容阅读
背景血管瘤是婴幼儿最常见的良性肿瘤。大多数位于头颈部，其次是躯干和四肢。大部分血管瘤位置比较表浅，但也有少数发生在黏膜、肌、骨组织和内脏。不仅影响生理功能和外观，还由于其造成的畸形或缺陷给患者带来极大的心理压力。另外，有一部分病变可能因出血、溃疡、感染或特殊部位而危及生命。但迄今为止，对其确切的发病机制仍不清楚，临床上缺乏理想的防治方法。因此，研究血管瘤的发病机理及其高效、特异的防治方法有非常重要的意义。目的利用RNAi技术抑制C57小鼠骨髓中MMP9的表达后，再用VEGF基因移植的方法构建血管瘤模型，观察是否可以形成血管瘤，从而证实VEGF是否通过激活MMP9来动员骨髓中的EPCs参与血管瘤的形成，为高效特异性的治疗血管瘤提供研究基础。方法1.针对MMP9靶基因设计siRNA序列，并合成小发卡RNA结构的DNA,与经AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞，构建成携带MMP9-shRNA慢病毒质粒载体（pSIL-RFP/MMP9-shRNA），PCR及测序鉴定后，Western blot筛选出携带最佳siRNA的慢病毒质粒载体，并利用慢病毒包装质粒（pHelper1.0和pHelper2.0）将其制备成MMP9-shRNA慢病毒，并测定病毒滴度。2.将10只6周龄雌性C57小鼠随机分为两组，实验组注射入小鼠双侧股骨骨髓腔MMP9siRNA慢病毒，对照组按同等剂量注射入小鼠双侧股骨骨髓腔空病毒。用Western blot的方法检测股骨骨髓细胞中MMP9的表达。3.慢病毒lenti-VEGF165-EGFP表达载体转染NIH/3T3细胞。RT-PCR和Western Blot分别从mRNA水平和蛋白水平检测VEGF165的表达。利用流式细胞仪挑选转染成功的细胞，将转染成功的表达人VEGF165的NIH/3T3细胞以1×107个分别注射入上述对照组和实验组小鼠的腓肠肌，从而构建小鼠的血管瘤模型。4.观察是否有血管瘤生成。用免疫组化的方法观察表达CD31的细胞是否参与血管瘤的形成。结果1. PCR和DNA测序证实合成的含基质金属蛋白酶9短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pSIL-RFP载体，表明实验成功构建基质金属蛋白酶9RNA干扰慢病毒表达载体。并测定病毒滴度为1×1010pfu/l。2.小鼠MMP9siRNA慢病毒转染了小鼠骨髓后，Western blot检测结果经灰度分析发现，MMP9siRNA慢病毒抑制了小鼠股骨骨髓中MMP9的表达。3.慢病毒lenti-VEGF165-EGFP转染NIH/3T3细胞后，经流式细胞仪分选出稳定表达人VEGF165的NIH/3T3细胞株。4.用VEGF165基因移植的方法建立了稳定的小鼠血管瘤模型。43天后HE染色发现对照组细胞植入部位有大量血管组织的新生，免疫组化显示在围成规则或不规则管状结构中有强表达的CD31细胞。实验组发现细胞植入部位有较少的血管组织新生，免疫组化显示较少表达的CD31细胞。结论1.成功构建MMP9RNA干扰慢病毒，并可抑制C57小鼠骨髓中MMP9的表达。2.成功地建立了稳定表达人VEGF165的NIH/3T3细胞株。3.用VEGF165基因移植的方法构建了小鼠血管瘤模型。4.证实了骨髓中MMP9在血管瘤生成中起重要作用。抑制骨髓中MMP9的表达，可能阻止血管瘤的生成。