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本论文以光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019为研究模型,借助全基因组规模代谢网络模型i NX804(Genome scale metabolic model i NX804,GSMM i NX804)深入分析富马酸所参与的代谢途径,结合系统代谢工程与合成生物学的相关技术手段,从系统生物学水平上研究和改造快速高效的富马酸代谢路径、增强富马酸代谢路径中中间代谢物的传输效率、抑制富马酸生产过程中副产物的产生,从而降低碳流的流失、提高富马酸的积累量。主要研究结果如下:1.借助T.glabrata基因组规模代谢网络模型i NX804,对富马酸前体苹果酸合成途径进行计算,并结合文献挖掘,确定苹果酸最佳合成途径为胞质还原路径,这一途径涉及到丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PYC)和苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH);利用代谢工程策略将源于Rhizopus oryzae的PYC和MDH,过量表达于T.glabrata中构建苹果酸合成的胞质还原途径,苹果酸积累量由0.80 g/L提高到4.8 g/L;通过对苹果酸胞质还原途径进行代谢流限制性模拟分析,发现限制胞外苹果酸高效积累的瓶颈在于转运能力弱,进而将源于Schizosaccharomyces pombe的苹果酸转运基因Sp MAE1过量表达,最终苹果酸积累量达到8.5 g/L;2.富马酸酶作为TCA循环中的重要酶,能够催化苹果酸脱水生成富马酸,是R.oryzae富马酸积累路径中的关键酶。然而,该胞质富马酸酶对底物富马酸的亲和力是对苹果酸的17倍。为了改善该酶的催化效率,采用分子对接的方法筛选出在底物结合位点B区域内具有改善催化效率的潜在突变位点H159S、H159Y、H159V、P160A、P160H、P160T、N161R、N161E、N161F、D162W、D162K和D162M。通过对富马酸酶进行定点突变,测定突变酶的动力学参数(如:Km、kcat、kcat/Km等),筛选出突变体P160A,使得Km降低了53.2%,kcat/Km提高了33.2%。最后,通过在苹果酸生产菌株T.G-PMS中表达突变体P160A,获得的工程菌株T.G-PMS-P160A能够积累5.2 g/L富马酸;3.利用线粒体工程修饰改造氧化TCA循环,构建富马酸高效合成路径,涉及的关键酶为α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutarate dehydrogenase complex,KGD)、琥珀酰Co A合成酶(succinyl-Co A synthetase,SUCLG)和琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)。通过构建融合蛋白KGD2-SUCLG2,提高路径底物传输效率;通过控制KGD2-SUCLG2和SDH1的基因表达水平,优化富马酸合成路径。上述改造获得的工程菌株T.G-KS(H)-S(M)的富马酸积累量达到8.24 g/L。另外,通过分析以α-酮戊二酸为前体的胞内氨基酸水平(如:Glu、Gln、Lys和Pro)和涉及该氨基酸代谢的关键基因表达水平,确定了关键代谢瓶颈为精氨琥珀酸裂解酶(Argininosuccinate lyase,ASL),并对ASL进行了过量表达。最后,利用转运子SFC1和Sp MAE1实现了富马酸的有效转运,最终改造的工程菌株T.G-KS(H)-S(M)-A-2S能够积累15.7 g/L的富马酸； 4.借助T.glabrata GSMM i NX804,挖掘所有富马酸相关的代谢途径,包括:TCA还原路径、尿素循环、嘌呤核苷酸循环和氨基酸代谢路径,并分别进行代谢工程改造研究不同路径对富马酸合成的影响,最终确认尿素循环与嘌呤核苷酸循环为富马酸生产的最佳路径,涉及的关键酶分别为精氨琥珀酸裂解酶(Argininosuccinate lyase,ASL)和腺嘌呤琥珀酸裂解酶(Adenylosuccinate lyase,ADSL)。当控制ASL和ADSL的表达水平分别为高和低时,工程菌株T.G-ASL(H)-ADSL(L)的富马酸积累量达到5.62 g/L。另外,借助转运工程策略,将源于S.pombe的二羧酸转运蛋白Sp MAE1在工程菌T.G-ASL(H)-ADSL(L)中进行过量表达,最终工程菌T.G-ASL(H)-ADSL(L)-Sp MAE1能够积累8.83 g/L富马酸;5.通过重新剪接碳代谢网络,选择了富马酸合成路径中的10个必需基因,并将其划分为3个模块:还原模块(PMFM模块)、氧化模块(KSSS模块)和副产物模块(RPSF模块)。通过将PMFM模块和KSSS模块分别定位到细胞质与线粒体中,能够将更多的代谢流导向富马酸合成。利用蛋白质工程,获得富马酸酶突变体P160A、构建融合蛋白Ro MDH-P160A和KGD2-SUCLG2,有效地改善了底物的传输效率;通过优化路径中基因表达强度,实现了代谢流的平衡,从而大幅度提高了富马酸的积累量。当控制Ro MDH-P160A、Ro PYC、KGD2-SUCLG2和SDH1的表达水平分别为高、高、高和中时,工程菌TGFA091-12的富马酸积累量达到20.46 g/L。另外,通过构建DNA绞手架固定Ro PYC和Ro MDH-P160A进行协同催化、合成s RNA开关s RNA-RHR2和s RNA-PDC6降低副产物的积累,进一步提高了富马酸的积累量,达到33.13 g/L。