第一部分IGFBP7、VEGF、Caspase-3在恶性黑素瘤的表达目的研究IGFBP7、VEGF、Caspase-3在C57BL／6J荷瘤鼠B16-F10恶性黑素瘤中的表达,探讨IGFBP7作为恶性黑素瘤基因治疗靶点的可能性。方法培养B16-F1O鼠恶性黑素瘤细胞系,将B16-F10细胞制成细胞悬液注射入C57BL／6J荷瘤鼠背部；待5周B16-F10恶性黑素瘤组织形成后,手术取下标本,并用免疫组化检测IGFBP7、VEGF、Caspase-3在上述恶性黑素瘤组织中的表达；分析IGFBP7与VEGF、Caspase-3表达的相关性。结果培养B16-F1O细胞及构建恶性黑素瘤荷瘤鼠模型成功。病理示肿瘤组织内细胞呈梭形,异形性明显；免疫组化S100在该黑素瘤细胞中强表达,证实为恶性黑素瘤。IGFBP7在C57BL／6J小鼠皮肤中的表达较荷瘤鼠恶性黑素瘤组织中的表达高(W=261.50,P<0.01); VEGF在荷瘤鼠恶性黑素瘤组织中的表达较C57BL／6J小鼠皮肤高(W=237.0, P<0.01); Caspase-3在C57BL／6J小鼠皮肤中的表达高于荷瘤鼠恶性黑素瘤组织(W=341.0, P<0.05)。IGFBP7与VEGF在上述两种组织中的表达呈负相关,Spearman相关分析表明(IGFBP7和VEGF rs=-0.631, P<0.01); IGFBP7与Caspase-3在上述两种组织中的表达呈正相关,Spearman相关分析表明(IGFBP7和Caspase-3rs=0.728,P<0.01)。结论B16-F10恶性黑素瘤组织中IGFBP7表达缺失可能是其恶变的关键步骤；且VEGF在恶性黑素瘤中高表达、Caspase-3低表达。IGFBP7与VEGF呈负相关、IGFBP7与Caspase-3呈正相关。表明IGFBP7是恶性黑素瘤基因治疗的理想的靶点,上调IGFBP7表达可能可以通过抑制VEGF表达及增加Caspase-3促进恶性黑素瘤凋亡来抑制肿瘤生长。第二部分pcDNA3.1-IGFBP7真核表达载体的构建目的构建pcDNA3.1-IGFBP7真核表达载体,为恶性黑素瘤体内、外基因治疗作准备。方法提纯pcDNA3.1及pOTB7-IGFBP7,并用DNA的限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ消化上述质粒；通过凝胶回收IGFBP7 cDNA,用T4DNA连接酶将经酶切消化的线性pcDNA3.1与回收的I GFBP7 cDNA片段连接,以构建成pcDNA3.1-IGFBP7真核表达载体。将pcDNA3.1-IGFBP7转化入E.coli DH5α,经筛选后,摇菌扩增pcDNA3.1-IGFBP7；用酶切消化、凝胶电泳及测序等方法,鉴定是否成功构建pcDNA3.1-IGFBP7.结果pcDNA3.1-IGFBP7经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切消化及凝胶电泳后,结果显示酶切片段符合目的片段,大小约1100bp；质粒测序pcDNA3.1-IGFBP7的序列正确,符合目的IGFBP7 cDNA序列。结论pcDNA3.1-IGFBP7构建成功,为BRAF基因V600E位点突变的恶性黑素瘤体内、外基因治疗奠定了基础。第三部分pcDNA3.1-IGFBP7体外抑制黑素瘤细胞生长基因治疗目的探讨体外转染pcDNA3.1-IGFBP7是否能抑制B16-F10生长及促进该鼠恶性黑素瘤细胞系凋亡。方法将培养的B16-F1O细胞分为pcDNA3.1-IGFBP7组、pcDNA3.1-CONTROL组、空白对照组(不转染组),采用Effectene将质粒转染入B16-F10恶性黑素瘤细胞；并用RT-PCR. CCK8.流式细胞仪分别检测三组中IGFBP7mRNA的表达、恶性黑素瘤细胞的增殖性及生存活力、以及恶性黑素瘤细胞凋亡情况。结果成功转染pcDNA3.1-IGFBP7,转染率达50%-60%；在转染48小时内IGFBP7mRNA的表达与pcDNA3.1-IGFBP7质粒浓度呈剂量依赖性；质粒体外转染后的1、3、6、12天,pcDNA3.1-IGFBP7组与pcDNA3.1-CONTROL组、空白对照组相比IGFBP7mRNA的表达量分别上升了4、8、7、6倍(P<0.01)。而B16-F10黑素瘤细胞转染pcDNA3.1-CONTROL质粒并未增加IGFBP7mRNA的表达,且pcDNA3.1-CONTROL组与空白对照组两组间IGFBP7 mRNA、β-actin mRNA的表达量差异无显著性(P>0.05),实验结果提示pcDNA3.1-IGFBP7质粒可增加I GFBP7mRNA表达且不对β-actin mRNA的表达造成影响。转染了pcDNA3.1-IGFBP7质粒48小时后B16-F10黑素瘤细胞的增殖明显受到抑制(P<0.01)。其抑制增殖效应随pcDNA3.1-IGFBP7质粒浓度的增加而上升,呈剂量浓度依赖性。最大的抑制效应出现在pcDNA3.1-IGFBP7(质粒量为1μg)在转染24小时后,而转染pcDNA3.1-CONTROL及无质粒转染组的细胞增殖差异无显著性；实验结果表明转染pcDNA3.1-IGFBP7可通过增加IGFBP7的合成及分泌抑制B16-F10细胞的增殖。流式细胞仪检测结果显示转染pcDNA3.1-IGFBP7质粒24小时后,pcDNA3.1-IGFBP7组中B16-F10的凋亡率为24.6％,pcDNA3.1-IGFBP7细胞凋亡明显较上述两对照组高,差异具显著性(P<0.01)；而在pcDNA3.1-CONTROL转染组及无质粒转染组其凋亡率差异无明显性(P>0.05)。结论pcDNA3.1-IGFBP7体外可抑制B16-F10恶性黑素瘤细胞生长并可有效促该细胞凋亡,为体内抑制恶性黑素瘤基因治疗的研究奠定了基础。第四部分pcDNA3.1-IGFBP7体内抑制恶性黑素瘤生长基因治疗目的探讨瘤内注射pcDNA3.1-IGFBP7进行体内基因治疗是否能抑制荷瘤鼠恶性黑素瘤的生长以及相应的机制。方法将36只B16-F1O恶性黑素瘤随机分为pcDNA3.1-IGFBP7. pcDNA3.1-CONTROL.B16-F10三组;pcDNA3.1-IGFBP7组采用invivofectamine(体内转染试剂)+pcDNA3.1-IGFBP7质粒螯合混悬物瘤内注射,pcDNA3.1-CONTROL组采用invivofectamine+pcDNA3.1-CONTROL质粒螯合混悬物瘤内注射,而B16-F10组采用invivofectamine+DMEM瘤内注射；治疗过程中观察各组恶性黑素瘤生长情况及荷瘤鼠的生存率,用免疫印迹检测转染后各组IGFBP7蛋白的表达；此外,用免疫组织化学及TUNEL分别检测各组恶性黑素瘤组织中IGFBP7.VEGF.Caspase-3及肿瘤中凋亡情况；分析各组IGFBP7的表达与VEGF. Caspase-3以及肿瘤细胞凋亡的相关性。结果pcDNA3.1-IGFBP7组,pcDNA3.1-CONTROL组,及B16-F10组的生存率分别是75%、50%、41.7%。结果表明pcDNA3.1-IGFBP7体内基因治疗可以明显提高荷瘤鼠生存率。在25天处死荷瘤鼠时,B16-F10组小鼠、pcDNA3.1-CONTROL组小鼠的肿瘤体积分别为587±35mm3、566±34mm3；然而注射pcDNA3.1-IGFBP7的小鼠其肿瘤体积为256±25mm3。瘤内注射pcDNA3.1-IGFBP7可明显遏制的肿瘤生长,与对照组相比差异具显著性(F=256.1,P<0.0014)。免疫印迹检测IGFBP7的表达,结果示pcDNA3.1-IGFBP7组瘤内注射转染pcDNA3.1-IGFBP7后可明显增加IGFBP7的表达,而pcDNA3.1-CONTROL与B16-F10组中IGFBP7的表达较低且程度一致,三组β-actin的表达量无明显区别；表明pcDNA3.1-IGFBP7可特异性促进IGFBP7的表达,pcDNA3.1空质粒不能促进IGFBP7的表达且对β-actin的表达无影响。pcDNA3.1-IGFBP7与pcDNA3.1-CONTROL转染率相同,大约为50%；免疫组织化学检测结果提示pcDNA3.1-IGFBP7组中IGFBP7表达明显高于pcDNA3.1-CONTROL与B16-F1O组(P<0.01), pcDNA3.1-CONTROL与B16-F1O组之间IGFBP7表达差异无显著性(P>0.05).VEGF在pcDNA3.1-IGFBP7组中的表达明显较pcDNA3.1-CONTROL组及无注射质粒组者低(P<0.006)差异具显著性；Caspase-3在注射pcDNA3.1-IGFBP7组小鼠瘤内中的表达明显较pcDNA3.1-CONTROL组及无注射质粒组者高(Caspase-3 P<0.004),差异具显著性。我们发现IGFBP7的表达与Caspase-3和细胞凋亡呈正相关,相关系数分别为(rs=0.704,rs=0.806,P<0.01)。而IGFBP7与VEGF的表达呈负相关,相关系数为(rs=-0.564,P<0.01)。结论瘤内注射pcDNA3.1-IGFBP7基因治疗方法不仅可以在BRAFV600E阳性恶性黑素瘤中促进IGFBP7的表达,而且可以在体内通过减少VEGF的生成及诱导肿瘤细胞凋亡来抑制恶性黑素瘤的生长。