论文部分内容阅读
目的： 1.本研究拟探索MEG3和miR-144在结肠癌细胞中的表达状况，分析其相关性及临床意义； 2.本研究拟探讨MEG3与miR-144的相互作用，并进一步研究其下游相关通路在结肠癌增殖和转移的过程中的功能及机制，为结肠癌的诊断和治疗提供新的靶向标志物。 方法： 1.收集手术切除并且经病理检查确诊为结肠癌患者的癌组织80例，同时取配对癌旁正常结肠组织80例作为对照； 2.采用实时荧光定量PCR技术（RT-PCR），检测MEG3和miR-144在不同结肠癌细胞株（HT29、SW0480、SW620及RKO细胞株）中的表达水平；检测MEG3在结肠癌组织以及癌旁正常组织中的表达并使用SPSS22.0软件进行临床数据统计分析； 3.通过慢病毒技术构建MEG3-siRNA和miR-144-inhibitor病毒载体，采用lip2000分别将以上载体转染进入结肠癌细胞SW620，获得MEG3和miR-144稳定低表达结肠癌细胞株。 4.应用双荧光素酶报告基因检测技术验证MEG3与miR-144之间的靶向关系； 5.利用MTT增值实验方法以及Transwell侵袭实验方法检测外源性抑制MEG3基因表达后结肠癌细胞的增殖能力与侵袭能力的变化；并检测外源性抑制miR-144表达后，结肠癌细胞增殖能力和侵袭能力的恢复情况； 6.蛋白质印迹法检测抑制MEG3后PTEN/AKT信号通路蛋白的表达情况。 结果： 1.与其他结肠癌细胞株相比，SW620细胞中MEG3表达最低（0.52±0.08），t＝9.968，P＜0.001，miR-144的表达水平最高（1.25±0.11），t=9.648，P＜0.05；结肠癌组织中MEG3的表达水平相比癌旁正常组织明显降低；MEG3的表达水平与结肠癌的病理分期相关以及淋巴结转移情况有关，随着分期越高，MEG3在结肠癌组织中表达越低，淋巴结转移的患者中MEG3的表达也相对较低； 2.双荧光素酶报告实验证实MEG3能与miR-144的3’UTR段特异性结合，可以调控miR-144的表达与活性； 3.外源性抑制MEG3的表达后；与转染空载体的对照相比，结肠癌细胞的增殖能力（3.52±0.59），t＝3.289，P＜0.05和侵袭能力明显增加（321.52±23.24），t＝15.900，P＜0.001，并且差异有统计学意义；与此同时，外源性抑制miR-144的表达水平后，与转染空载体的对照相比，结肠癌细胞的增殖（3.63±0.48），t＝4.303，P＜0.05）和侵袭能力（89.52±8.19），t＝15.327，P＜0.001明显恢复，差异具有统计学意义； 4.抑制MEG3的表达后，蛋白印迹实验表明PTEN（1.19±0.15）％，t＝10.954，P＜0.001和AKT（1.29±0.18）％，t＝8.881，P＜0.001的蛋白表达水平相对转染空载体的对照明显升高； 结论： 1.MEG3在结肠癌患者中存在异常低表达，并且与结肠癌的发展及临床分期有一定的相关性，随着结肠癌的发生发展，MEG3的表达水平相应降低，这说明MEG3在结肠癌中可能发挥一个抑癌基因的作用； 2.MEG3可以通过调控miR-144的表达来激活PTEN/AKT信号通路，从而影响结肠癌细胞的增殖能力和侵袭能力，这将为结肠癌的诊断和治疗提供新的靶向标志物。