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目的:基质干细胞(Mesenchymal/stromal stem cells,MSCs)具有多向分化的潜能,既可以向成骨细胞分化,又可以向脂肪细胞分化,其分化过程受内外环境多种因素的影响,且成骨和成脂的分化具有相互制约作用,以达到一个动态平衡态状态。Sprouty(SPRY)是一类在全身组织广泛表达的软脂酰化磷蛋白家族,具有相对保守的序列。研究发现部分SPRY蛋白可能与骨发育过程有关,本研究旨在探究SPRY4对成骨细胞和脂肪细胞分化的作用及其机制。方法:1.通过qRT-PCR技术检测Spry4在野生型小鼠各组织中的表达分布情况;分离并培养C57BL/6J小鼠原代骨髓基质干细胞(BMSCs),通过qRT-PCR技术检测其向成骨细胞和脂肪细胞分化过程中Spry4的表达变化;2.在骨髓基质细胞系ST2和MSCs中分别过表达Spry4后诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,比较分化水平的差异。3.在ST2和MSCs中分别敲减Spry4后诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,比较分化水平的差异。4.在ST2细胞中过表达和敲减Spry4后,通过免疫荧光及Western blotting技术检测SPRY4对Wnt/β-catenin信号通路的影响,通过Western blotting检测SPRY4对丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的影响,揭示SPRY4调节骨髓基质干细胞成骨分化的机制。5.在ST2细胞过表达和敲减Spry4后,通过Western blotting检测SPRY4对AKT/mTORC1信号通路的影响;采用阻断实验检测阻断mTORC1通路后是否可以阻断SPRY4对脂肪细胞分化的促进作用。结果:1.诱导MSCs向成骨细胞分化过程中Spry4的表达水平降低,且在成骨诱导第8 d时表达水平最低;诱导MSCs向脂肪细胞分化过程中Spry4的表达水平上升,且在诱导2d时表达水平最高;Spry4在各组织中广泛分布,其中在骨组织中的表达量较其他组织高。2骨髓基质细胞系ST2进行基因转染后诱导成骨细胞分化,过表达Spry4可使细胞成骨分化减弱,表现为ALP染色减弱,成骨分化特异性转录因子Runx2和标志基因Alp和骨桥蛋白(Osteopontin,Opn)的水平均降低。过表达Spry4后诱导脂肪细胞分化可使细胞成脂分化加强,表现为油红O染色阳性的细胞增多,染色定量增加,脂肪特异性转录因子C/EBPα、PPARγ和标志基因aP2和adipsin等的mRNA和蛋白水平增加。3.采用siRNA转染骨髓基质细胞系ST2敲减Spry4内源性表达,诱导成骨细胞分化,检测结果表明Spry4基因敲减可使细胞成骨分化加强,表现为ALP染色增强,成骨分化特异性转录因子Runx2和标志基因Alp和Opn的水平降低。诱导脂肪细胞分化后,Spry4基因敲减可使细胞成脂分化减弱,表现为油红O染色阳性的细胞减少,染色定量减少,脂肪特异性转录因子C/EBPα、PPARγ和标志基因aP2和adipsin的mRNA和蛋白水平降低。采用Spry4 shRNA LV敲减慢病毒感染原代MSCs后进行成骨细胞和脂肪细胞诱导分化,研究结果也表明在MSCs中当降低内源性Spry4的表达促进成骨细胞分化而抑制脂肪细胞分化。4.在ST2细胞过表达Spry4可以抑制经典Wnt通路活性,表现为β-catenin由细胞浆向胞核的转移减少,p-LRP6、细胞总β-catenin(t-β-catenin)、非磷酸化β-catenin(non-p-β-catenin)和胞核β-catenin及TCF7L2等蛋白水平降低。相反,降低内源性Spry4的表达水平后经典Wnt通路活性升高,表现为β-catenin的入核增多,t-β-catenin、non-p-β-catenin和胞核β-catenin、TCF7L2等蛋白水平升高。5.在ST2细胞过表达Spry4可以减少细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)的激活,表现为p-ERK1/2的蛋白水平较对照组明显降低,而降低内源性Spry4后结果与此相反。6.采用ERK1/2的抑制剂U0126处理细胞后Wnt信号通路被抑制,表现为t-β-catenin、non-p-β-catenin和p-LRP6蛋白水平降低。7.在ST2细胞过表达Spry4后,AKT/mTORC1通路被激活,表现为p-AKT、p-mTOR、p-S6K1、p-RPS6和p-4EBP1蛋白水平增加;相反,在ST2细胞敲减Spry4后,AKT/mTORC1通路受抑制,表现为p-AKT、p-mTOR、p-S6K1、p-RPS6和p-4EBP1蛋白水平减少;采用雷帕霉素(RAPA)阻断ST2细胞mTORC1通路后可以阻断SPRY4对脂肪细胞分化的促进作用,表现为RAPA处理的Spry4过表达细胞较之阴性对照处理者脂肪细胞分化减少,成脂特异性因子表达降低。结论:1.Spry4在成骨细胞分化过程中表达下降,而在脂肪细胞分化过程中表达上升。2.SPRY4可以抑制骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,并促进其向脂肪细胞分化。3.SPRY4通过抑制ERK1/2和经典Wnt信号通路而抑制骨髓基质干细胞的成骨分化。4.SPRY4通过激活mTORC1信号通路而促进骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化,抑制mTORC1可以阻断SPRY4的促成脂作用。