镉(Cadmium,Cd)作为重要的重金属污染物,近年来已成为热门研究课题。镉被广泛应用于制造镍镉电池、颜料、合金和电镀等行业,导致每年有大量的镉通过工业活动排入环境,经由雾霾、污水、食物链等途径后大量积累,进入人体并危及人体健康。目前对于镉的生物学毒性的研究已经广泛而深入,研究表明,镉可造成氧化损伤及对离子通路和蛋白活性的干扰,激活p53或Caspase-3凋亡通路等等。镉还可以诱发表观遗传变异,改变原有的DNA甲基化修饰模式,从而影响基因表达与基因组的稳定性。DNA甲基化作为表观遗传研究的重要方面,可通过对特定基因的沉默、抑制有丝分裂与转录等途径来应对镉暴露等外界环境因子带来的压力胁迫,DNA甲基化模式的改变还可能是起始凋亡的重要因素之一。果蝇作为一种经典的模式生物,具备简单而高效的DNA甲基化修饰系统。为探究镉对黑腹果蝇DNA甲基化以及凋亡相关基因的影响,本研究利用黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)Canton-S品系作为实验动物,共分为以下三部分进行研究。一、应用Real-time PCR技术分析镉对果蝇DNA甲基化相关基因的表达改变及其性别差异与可遗传性。检测了在不同浓度(0、0.9375、1.875、3.75、7.5、15、30.60mg/L)Cd处理后亲代(F0)果蝇精巢、卵巢、去精巢、去卵巢残体、整体及解除胁迫的子代(F1)果蝇DNA甲基化修饰系统相关基因(dDNMT2、dMBD2/3)在mRNA水平的表达量变化趋势。结果显示,与对照组相比,重金属Cd胁迫诱导了亲代果蝇所有组别的dDNMT2、dMBD2/3在mRNA水平的表达上调,随着镉暴露浓度升高其表达呈上升趋势,呈一定剂量依赖性。比较其相对于内参的表达量发现精巢、卵巢大于整体大于去生殖残体,雌雄间比较发现雌性大于雄性(P<0.05),比较其相对于对照组表达倍数的差异发现精巢、卵巢大于整体大于去生殖残体,但由于雌性对照组表达显著高于雄性,因此其表达倍数低于雄性(P<0.05)而且这种表达变化模式具有可遗传性,能够持续至子一代。二、应用二代测序技术中的数字基因表达谱(Digital Gene Expression,DGE)技术对雌性果蝇在镉处理半致死浓度下(52mg/L)全部mRNA碱基序列进行高通量测序分析。结果显示,对照组CK和处理组TG都得到了接近600万条原始标签,去除杂质标签并进行比对后,发现CK组有4906113(87.09%)个特异性匹配,TG组有5118729(90.09%)个特异性匹配。对差异表达基因进行分析,发现共有1443个基因显著上调,527个基因显著下调。进一步筛选目的基因,并关注DNA甲基化相关基因以及凋亡相关基因,发现4个显著差异表达基因参与DNA甲基化过程,除果蝇中直接参与DNA甲基化的甲基转移酶基因DNMT2和甲基结合蛋白基因MBD2/3,还发现两个通过组蛋白进行间接调控的基因Su (var)205、dSETDB1。细胞凋亡通路中,有8个显著差异表达基因被发现,其中端粒调控因子tefu在p53上游上调表达,Caspase-3通路上调了CG17019、Damm并导致凋亡的最终发生。这些结果表明镉诱导表观遗传变异与细胞凋亡相关基因至少以共同作用的方式在镉毒性作用中起重要作用。果蝇DNA甲基化模式的改变对细胞凋亡过程相关基因转录活性的改变可能是果蝇中细胞凋亡发生的原因之一,其具体联系还有待于进一步研究的证实。三、应用Real-time PCR方法对上述筛选出的细胞凋亡相关基因进行检测,验证DGE数据的可靠性,并拓展实验条件以深入探讨其基因表达模式在不同镉剂量影响下的表达变化。对筛选出的细胞凋亡相关部分关键基因tefu、p53、Caspase-3、 CG17019、Damm在雌、雄果蝇在不同镉浓度(0、7.5、15、30、60mg/L)中的表达进行检测后,结果发现,与对照组相比,雌、雄果蝇凋亡相关基因均显著上调,但基因间有其特异性模式,性别间差异不显著,CG17019表现出先上调后下调的趋势,但下调后依然高于对照组的表达,其他检测基因均伴随着镉剂量的上升而上调,但相对于内参的表达量各有不同。综上所述,本研究着重分析了重金属镉对果蝇DNA甲基化修饰基因转录活性的影响,发现镉会上调dDNMT2、dMBD2/3的表达量并具有剂量效应,且具有可遗传性。该结果将为探讨镉诱导表观遗传变异研究奠定实验基础,对镉等重金属环境因子对人类的表观遗传风险等方面研究具有一定实际意义。利用数字基因表达谱筛选镉诱导下发生显著表达差异的细胞凋亡相关基因,将为更深入探讨果蝇应对镉压力胁迫下细胞发生凋亡的分子机制,以及之后探讨果蝇DNA甲基化对细胞凋亡的影响在基因层面提供研究支持,也将为进一步了解重金属诱导发生的细胞凋亡与表观遗传修饰系统之间可能的调控关系,对重金属导致的疾病提供新的对策。