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背景与目的信号通路调控失常与肿瘤发生紧密相关。作为重要的信号调控分子,PIAS3可以调节包括pSTAT3分子在内的许多转录因子的转录功能。研究表明,PIAS3在许多恶性肿瘤中都有表达,与正常组织比较表达量增加。在肿瘤的发生过程中,pSTAT3的作用不仅在于促进细胞的恶性增殖,而且能够促使肿瘤细胞分泌免疫抑制因子。胶质瘤是人脑常见的肿瘤,PIAS3在人胶质瘤中是否表达及其对胶质瘤细胞凋亡和细胞周期的作用目前尚不完全清楚。本课题通过免疫组织化学技术检测了PIAS3蛋白在胶质瘤中的表达及其与胶质瘤恶性程度的关系,构建PIAS3真核表达载体和RNAi载体,转染胶质瘤细胞后,检测胶质瘤细胞pSTAT3表达、凋亡和细胞周期变化,了解PIAS3对胶质瘤凋亡和细胞周期的影响。研究方法一、收集临床胶质瘤手术标本及外伤脑组织标本,胶质瘤根据世界卫生组织(WHO)标准分级进行分组。采用免疫组织化学的方法,检测胶质瘤标本和培养的胶质瘤细胞系中PIAS3的表达情况,使用细胞计数及统计学方法分析PIAS3与肿瘤的病理分级和恶性程度的相关性。二、设计和构建带有绿色荧光蛋白标记的PIAS3真核表达载体。用脂质体法将PIAS3表达载体转染人胶质瘤细胞系U251和CHG-5,转染48h后通过荧光显微镜观察转染细胞带有绿色荧光的融合蛋白表达;用半定量RT-PCR、Western blot检测未转染组、对照组和转染组细胞的PIAS3 mRNA和蛋白表达;采用FITC-Annexin V/ PI双标记法检测三组细胞凋亡变化;流式细胞仪观察增强PIAS3表达对胶质瘤细胞周期的影响。三、设计和构建三个RNAi载体,用脂质体法将其转染胶质瘤细胞系CHG-5,通过半定量RT-PCR检测PIAS3 mRNA的表达,筛选干扰效率最高的重组RNAi质粒。用脂质体将筛选出的重组RNAi质粒转染胶质瘤细胞系U251和CHG-5,转染48h后,用半定量RT-PCR、Western blot检测转染细胞PIAS3 mRNA和蛋白表达;用Western blot检测PIAS3真核表达载体转染和重组RNAi质粒转染细胞的pSTAT3蛋白含量;采用FITC-Annexin V/ PI双标记法检测RNAi后的细胞凋亡;流式细胞仪观察RNAi对胶质瘤细胞周期的影响。结果一、正常脑组织中未见PIAS3表达。胶质瘤中可检测到PIAS3表达,总阳性率为56% (28/50),胶质瘤中PIAS3阳性染色主要位于细胞核内,少量阳性产物位于细胞浆内。PIAS3表达与肿瘤的病理分级有关,Ⅳ级胶质瘤PIAS3染色阳性率显著高于Ⅰ～Ⅲ级胶质瘤(P<0.01)。高度恶性胶质瘤(Ⅲ+Ⅳ级) PIAS3染色的标记指数为22.6±14.4,显著高于低度恶性胶质瘤(Ⅰ+Ⅱ级,5.7±6.5) (P<0.01)。PIAS3在胶质瘤细胞系U251和CHG-5中均有表达。二、构建带有绿色荧光蛋白标记的PIAS3真核表达载体,经酶切及测序鉴定正确。转染U251和CHG-5细胞后,可见转染细胞内有绿色荧光标记的融合蛋白表达。转染细胞的PIAS3 mRNA和蛋白表达较未转染组和对照组增加(P<0.01)。提示转染PIAS3基因能够增强胶质瘤细胞内PIAS3的表达。PIAS3基因转染后光镜下可见部分细胞变圆,部分细胞脱落死亡。与未转染组和对照组相比,超表达PIAS3诱导U251细胞(P<0.01)和CHG-5细胞(P<0.05)凋亡增加。转染细胞的S期比例较未转染细胞增高,G2期比例降低(P<0.05)。三、构建并筛选的特异并有效抑制PIAS3 mRNA表达的RNAi载体。半定量RT-PCR、Western blot证明RNAi能够有效下调U251细胞和CHG-5细胞的PIAS3 mRNA (P<0.01)和蛋白表达(U251细胞,P<0.01;CHG-5细胞,P<0.05),表明RNAi能够能有效地抑制胶质瘤细胞的PIAS3表达。免疫组织化学检测到U251和CHG-5细胞中的pSTAT3蛋白,超表达PIAS3能降低U251细胞和CHG-5细胞内的pSTAT3蛋白质水平(P<0.05);RNAi抑制PIAS3表达后,U251细胞和CHG-5细胞内pSTAT3水平增高(P<0.05)。抑制PIAS3表达,光镜下可见RNAi组细胞较对照组增多,形态无明显改变。RNAi诱导胶质瘤U251细胞和CHG-5细胞拮抗凋亡(P<0.01),同时出现细胞周期的改变,U251细胞表现为G2期细胞比例升高,S期细胞比例降低(P<0.05);CHG-5细胞表现为G1期比例升高,G2期细胞比例降低(P<0.05)。结论一、PIAS3在人正常脑组织中没有表达,在人胶质瘤和胶质瘤细胞系中均有表达。PIAS3的表达程度(阳性率和标记指数)与胶质瘤病理分级(恶性程度)有关。二、转染构建的PIAS3真核表达载体能够增强胶质瘤细胞PIAS3表达。转染PIAS3基因可诱导胶质瘤U251细胞和CHG-5细胞凋亡增加,使S期细胞比例增高,G2期细胞比例降低。三、RNAi抑制胶质瘤细胞PIAS3表达。增强和抑制PIAS3表达后,U251细胞和CHG-5细胞内的pSTAT3蛋白水平相应地降低和升高。抑制PIAS3表达能够诱导胶质瘤U251细胞和CHG-5细胞拮抗凋亡,同时出现细胞周期改变,U251细胞表现为G2期细胞比例升高,S期细胞比例降低,CHG-5细胞表现为G1期比例升高,G2期细胞比例降低。