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目的:在针刺治疗哮喘临床有效基础上,基于嗜神经病毒标记技术,筛选大鼠肺俞穴与下呼吸道双向神经通路共同脑核团。方法:实验动物分组:SD大鼠共分5组,分别是正常组、肺俞顺标组、肺俞逆标组、下呼吸道顺标组、下呼吸道逆标组。正常组不做任何标记;下呼吸道顺标组和肺俞顺标组分别用HSV-EGFP标记传入神经通路;下呼吸道逆标组和肺俞逆标组分别用PRV531-CAG-GFP标记传出神经通路。肺俞穴传入神经通路嗜神经病毒HSV-EGFP顺行标记方法:确定第七颈椎棘突,沿后正中线向下找到第三胸椎下两肋间,旁开0.5cm肌肉处(肺俞穴),缓慢注射嗜神经病毒HSV-EGFP原液2μl(病毒量4×10~7PFU)到肺俞穴,静置2min,缓慢拔出微量注射器。肺俞穴传出神经通路嗜神经病毒PRV531-CAG-GFP逆行标记方法:方法同肺俞穴传入神经通路标记方法,注射逆行病毒PRV531-CAG-GFP原液2μl(病毒量4×10~7PFU)。下呼吸道传入神经通路嗜神经病毒HSV-EGFP顺行标记方法:微量注射器针头约伸入气管的中、下1/3交点处,喷注HSV-EGFP稀释液6μl(病毒量2.4×10~7PFU)到大鼠下呼吸道,立即将微量注射器抽离大鼠气道。下呼吸道传出神经通路嗜神经病毒PRV531-CAG-GFP逆行标记方法:方法同下呼吸道传入神经通路标记方法,喷注逆行病毒PRV531-CAG-GFP稀释液6μl(病毒量2.4×10~7PFU)。嗜神经病毒标记成功判断标准:HSV-EGFP标记组发病状态为眼神呆滞、鼻流血涕、步态蹒跚、活动迟缓等症状;PRV531-CAG-GFP标记组发病状态为鼻流血涕、四肢出血、精神亢奋、狂躁不安等症状。嗜神经病毒标记脑核团定位分析:灌注取材的时间节点根据大鼠发病状态决定。4%多聚甲醛固定液心脏灌注,脑组织冠状位冰冻切片,漂片法贴片,DAPI染色标记细胞核。采用全自动数字玻片扫描仪扫描组织玻片,结合大鼠脑立体定位图谱定位核团。结果:1、嗜神经病毒标记肺俞穴在大鼠器官组织中荧光信号分布情况:(1)大鼠肺俞穴注射HSV-EGFP转染至发病状态,与正常组器官组织切片比较,病毒标记处肺俞穴无荧光信号分布,内脏组织心、肝、脾、肾、气管、食管、肠、胃、肺均无荧光信号分布。(2)大鼠肺俞穴注射PRV531-CAG-GFP转染至发病状态,与正常组器官组织切片比较,病毒标记处肺俞穴无荧光信号分布,内脏组织心、肝、脾、肾、气管、食管、肠、胃、肺均无荧光信号分布。2、嗜神经病毒标记下呼吸道在大鼠器官组织中荧光信号分布情况:(1)大鼠下呼吸道内喷注HSV-EGFP转染至发病状态,与正常组器官组织切片比较,病毒标记处气管和肺无荧光信号分布,内脏组织心、肝、脾、肾、食管、胃、肠、肺俞穴均无荧光信号分布。(2)大鼠下呼吸道内喷注PRV531-CAG-GFP转染至发病状态,与正常组器官组织切片比较,病毒标记处气管和肺无荧光信号分布,内脏组织心、肝、脾、肾、食管、胃、肠、肺俞穴均无荧光信号分布。3、嗜神经病毒标记外周(下呼吸道或肺俞穴)在大鼠脑组织中荧光信号分布情况:大脑皮层、端脑、中脑、脑桥中均观察到荧光信号分布,荧光信号分布密度由低到高可分为:少量分布、分散分布和集中分布。4、嗜神经病毒标记下呼吸道和肺俞穴在脑组织中核团分布结果:(1)肺俞穴传入神经通路脑核团嗜神经病毒HSV-EGFP标记结果:中脑部分布于下丘脑、中脑导水管周围灰质、被盖背侧交叉、埃-韦二氏核、间质核、丘脑;脑桥部分布于动眼神经核、红核、脑桥网状核、后椎核、网状核、面神经核、外侧巨细胞旁核、内侧纵束、迷走神经运动背核、下橄榄核、孤束核、三叉神经脊髓束。(2)肺俞穴传出神经通路脑核团嗜神经病毒PRV531-CAG-GFP标记结果:端脑部分布于运动皮层、下丘脑、斜角带核、隔核、苍白球、丘脑核、杏仁核;中脑部分布于内囊、A13多巴胺细胞、内脏核、黑质纹状体束、背内侧核、视神经束、中脑导水管周围灰质、网状核、内侧乳头核、岩石核、缰核、红核、动眼神经核、三叉神经中脑束、中缝背核、顶盖脊髓束、被盖核、中缝核、内侧丘系;脑桥部分布于A5去甲肾上腺素细胞、上橄榄核、蓝斑、前庭上核、展神经核、楔束核、薄束核、孤束核、迷走神经运动背核、三叉神经核、腹侧呼吸组、下橄榄核。(3)下呼吸道传入神经通路脑核团嗜神经病毒HSV-EGFP标记结果:端脑部分布于皮层、丘脑、胼胝体、尾状核、苍白球、下丘脑、网状核、内囊、杏仁核、视神经束、中脑导水管周围灰质、动眼神经核;中脑部分布于缰核、埃-韦二氏核、红核;脑桥部分布于蓝斑、中缝大核、被盖核、三叉神经核、孤束核、迷走神经运动背核、下橄榄核。(4)下呼吸道传出神经通路脑核团嗜神经病毒PRV531-CAG-GFP标记结果:下丘脑、蓝斑、内侧纵束、腹侧呼吸组吻端、下橄榄核、孤束核、迷走神经运动背核。5、嗜神经病毒标记肺俞穴与下呼吸道神经通路共同核团:(1)肺俞穴传入神经通路与下呼吸道传出神经通路共同核团:下丘脑背区、内侧纵束、迷走神经运动背核、孤束核腹侧部、孤束核中间部、孤束核内侧部。(2)下呼吸道传入神经通路与肺俞穴传出神经通路共同核团:下丘脑室旁核内侧副细胞部、苍白球、内囊、动眼神经副交感核、内侧动眼神经副核、红核副细胞部、红核巨细胞部、中脑导水管周围灰质、埃-韦二氏核、背内侧下丘脑背核、下丘脑外侧穹窿周围部、A5去甲肾上腺素细胞、蓝斑、中缝大核、三叉神经脊束核极间部、内侧纵束、孤束核、迷走神经运动背核。(3)下呼吸道传入神经通路与肺俞穴传入神经通路共同核团:中脑导水管周围灰质、埃-韦二氏核、丘脑腹后内侧核、动眼神经副交感核、内侧动眼神经副核、红核副细胞部、外侧网状核、内侧纵束、迷走神经运动背核、三叉神经脊束核极间部、小细胞网状核、孤束核背外侧区、孤束核、下橄榄核内侧核。(4)下呼吸道传出神经通路与肺俞穴传出神经通路共同核团:下丘脑背区、下丘脑外侧穹窿周围部、内侧纵束、迷走神经运动背核、孤束核腹侧部、孤束核中间部、孤束核内侧部。6、肺俞穴和下呼吸道神经通路共同核团:孤束核、迷走神经运动背核、内侧纵束均参与4条神经通路(肺俞穴传入神经通路、肺俞穴传出神经通路、下呼吸道传入神经通路和下呼吸道传出神经通路),是肺俞穴与下呼吸道神经通路重要的共同脑核团。结论:(1)肺俞穴传入神经通路与下呼吸道传出神经通路共同脑核团包括下丘脑背区、内侧纵束、迷走神经运动背核、孤束核。(2)下呼吸道与肺俞穴的内脏-体表反应存在脑核团神经基础,在下丘脑室旁核内侧副细胞部、苍白球、内囊、下丘脑外侧穹窿周围部、背内侧下丘脑背核、A5去甲肾上腺素细胞、蓝斑、中缝大核、动眼神经副交感核、内侧动眼神经副核、中脑导水管周围灰质、红核副细胞部、红核巨细胞部、埃-韦二氏核、迷走神经运动背核、孤束核、内侧纵束和三叉神经脊束核极间部存在交汇整合。(3)肺俞穴与下呼吸道双向神经通路共同脑核团为孤束核、迷走神经运动背核和内侧纵束。