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手性环氧化物是有机合成中的重要合成砌块。其环氧官能团与亲核试剂反应后开环，可以衍生出一系列含手性官能团的化合物，是许多手性天然产物、药物的合成前体。 苯乙烯单加氧酶(Styrene monooxygenase，SMO)是实现不对称环氧化的重要生物催化剂之一。与传统的化学催化相比，具有高对映选择性、反应条件温和、环境友好等优点。SMO由StyA和StyB两个亚基组成，其游离酶往往不稳定。为了减轻环氧化物对游离酶的毒害，目前生物催化制备环氧化物主要采用全细胞催化。在此类催化反应过程通常需要加入有机溶剂，使得产生的环氧化物快速地转移到有机相进而减少其对酶的毒害。 目前生物催化制备手性环氧化物中存在的主要问题是:酶的催化活力有限;有机溶剂和环氧化物对酶和菌株的毒性较大。因此，本课题主要从以下两个方面进行了研究:第一，新型苯乙烯单加氧酶基因数据挖掘和表征;第二，全局转录机制工程改造大肠杆菌提高其有机溶剂耐受性和环氧化反应的全细胞催化效率。 首先，利用基因数据挖掘的方法首次从两株海洋细菌中克隆到两个SMO，它们分别是MlSMO(Marinobacterium litorale DSM2354)和PaSMO(Paraglaciecola agarilytica NO2)，并成功地在大肠杆菌中实现了可溶性表达。两个酶的全细胞催化反应最适温度和pH皆为30℃和8.0。且两者皆能催化硫醚类化合物、共轭和非共轭的苯乙烯类衍生物，且ee值均大于99％。MlSMO对大部分测试的底物，均具有最高的催化活性;尤其对共轭苯乙烯类衍生物，如苯乙烯、肉桂醇和2，3-二氢-4-丙基苯并呋喃，相比较于之前报道过的PsSMO(Pseudomonas sp.LQ26)，MlSMO的转化率分别是PsSMO的3.0、3.4和2.6倍。 其次，利用全局转录机制工程的方法对大肠杆菌进行了改造，提高其有机溶剂耐受性和环氧化反应全细胞催化效率。构建了转录调控因子σ70编码基因rpoD的随机突变文库，结合有机溶剂压力下生长筛选的方法。筛选到一株能耐受30％(V/V)环己烷的突变子rpoD1。该突变子与MlSMO共表达之后，使苯乙烯环氧反应的转化率提高了50％。除此之外，我们找到了两个有助于提高大肠杆菌有机溶剂耐受性和环氧化反应全细胞催化效率的基因(pepB和robA)。这两个基因(pepB和robA)与rpoD1共表达，对提高大肠杆菌环氧化反应全细胞催化效率有叠加的作用，相对于母本，转化率分别提高了71.4％和82.8％。 第三，为了直接通过全局转录调控工程筛选到环氧化转化率提高的突变株，利用无痕基因敲除的方法构建了吲哚合成途径缺失的大肠杆菌MG1655(△tnaA)。将rpoD的随机突变文库与MlSMO的表达载体共转化入MG1655(△tnaA)中。结合MlSMO能催化吲哚生成蓝色物质靛蓝的特性，利用含有吲哚的固体平板筛选方法，获得一个能使环氧化转化率提高59％的突变子rpoD2。荧光定量PCR研究发现过表达rpoD2使MlSMO的mRNA水平上调了1.5倍。 最后，根据rpoD1的测序结果发现rpoD基因的截短对提高菌株有机溶剂耐受性非常重要。因此，为了进一步提高过表达了rpoD2菌株的有机溶剂耐受性，对rpoD2不同区域进行了截短研究。结果发现只保留rpoD2的region1.1和region1.2的突变子rpoD2-2过表达能使菌株耐受30％环己烷。且能提高菌株的环氧化反应催化效率，相比较于rpoD2，苯乙烯环氧化反应的转化率提高了12.5％。而且rpoD2-2与有机溶剂耐受性基因robA的共表达，对提高菌株有机溶剂耐受性和环氧化反应的转化率有叠加效果，相比较于rpoD2-2，苯乙烯环氧化反应的转化率和环己烷耐受能力分别提高了10.6％和53.3％。 综上所述，本研究利用基因数据挖掘的方法从两株海洋细菌中分别筛选到两个新型的、高催化活性的苯乙烯单加氧酶。通过全局转录机制工程改造大肠杆菌，提高了其有机溶剂耐受性和环氧化反应全细胞催化效率。本研究成功地优化构建了SMO催化的不对成环氧化反应全细胞催化体系，有利于进一步推动不对称生物环氧化在有机合成中的应用。