研究背景血管钙化是心血管疾病与终末期肾病、衰老和糖尿病之间的重要桥梁,是导致心血管疾病死亡的主要危险因素,是终末期肾病和糖尿病患者死亡的预测因子。最近研究发现,无论是临床试验还是基础实验模型中,磷酸盐(Pi)水平都是导致血管钙化的关键。血管钙化是一种主动的细胞调节过程,而不是单纯的被动钙盐沉积。血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的潜在机制涉及:1)细胞凋亡,基质囊泡(MVs)释放;2)血管平滑肌细胞表型转化,表达成骨样细胞表型标志物,失去平滑肌细胞收缩表型标志物,如α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)、钙调蛋白(calponin)、平滑肌22α(sm 22α)并表达骨性标志物,如核心结核因子α1(core binding factor α1,Cbfa1/Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白、骨钙蛋白、骨形成蛋白2和成骨特异性转录因子(osterix);3)抑制血管钙化发生的蛋白表达减少或缺失,如基质Gla蛋白(MGP)、基质蛋白A(fetuin-A)、骨桥蛋白(OPN);4)循环系统中旁分泌因子的作用,如甲状旁腺激素(PTH);5)基质降解,血管重构。细胞凋亡和凋亡的产物-基质囊泡被认为是血管钙化的起始点或起始环节。特异性蛋白1(Specificity protein 1,Sp1)是一种转录因子,是Sp/KLF转录因子家族的首先被发现的一员。研究发现,人类基因组中有Sp1结合位点,这解释了Sp1作为转录激活因子或抑制因子的作用,包括细胞生长、分化、凋亡、染色质重构、纤维化、炎症和DNA损伤。有研究证实Sp1可直接与collagen Ⅰ的GC盒和TCCTCC模体结合,然后促进其转录。光辉霉素(mithramycm)可以与Sp1 DNA序列上GC富集区结合,从而抑制Sp1与其靶基因对应结合位点相结合,是Sp1的特异性抑制剂。应用基因敲除Sp1或者应用Sp1的特异性抑制剂光辉霉素抑制Sp1的DNA结合活性都能明显减少Collagen Ⅰ的合成。鉴于Sp1的上述功能与血管钙化的病理密切相关,我们推测Sp1可能参与了血管钙化的调控。BMP2不仅是一种骨性标志物,还是转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成员之一。BMPs具有诱导骨形成的作用,其中骨形态发生蛋白2(BMP-2)的作用与血管钙化最为密切。BMP2已被证实在许多病理状态中发挥着重要作用,如癌症、关节炎和出生缺陷中,同时在骨发育中发挥关键作用,能够启动和调节骨形成和血管钙化。BMP2可能通过增加磷酸盐的吸收、诱导VSMCs表型转化为成骨样细胞来促进血管钙化,进一步促使SMAD1/5/8的磷酸化并上调下游关键的成骨细胞转录因子Runx2和Sp7(Osterix)。此外,下游的Runx2能够诱导骨相关基质蛋白表达,如骨钙素(OCN)、Ⅰ型胶原α1(CollA1)和骨桥蛋白(OPN)。此外,BMP2启动子序列包含可与Sp1结合的特异性序列,为Sp1的潜在靶基因。综上,BMP2在血管钙化中发挥着关键作用。研究发现血管平滑肌细胞凋亡早在钙化发生之前已经出现,具有浓缩钙质使之成为磷灰石晶体钙的成核结构而促进血管钙化,而钙化结节的数量可通过调控VSMCs的凋亡影响。此外,大量的研究证实,血管中膜凋亡降解产物-基质囊泡是血管钙化的启动环节,这表明基质囊泡在血管钙化的病理生理过程中起到了举足轻重的作用。基质囊泡(Matrix vesicles,MVs)是一种100～700nm大小的膜包裹结构,由多种细胞分泌,这些基质囊泡富含组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP),并含有大量的钙和磷,形成了一个高钙、高磷的微环境,提供了具有膜结合能力的碱性磷酸酶,为钙化的发生创造了必要条件。最近研究表明抗骨质疏松的药物,如雌激素、双磷酸盐、骨蛋白酶,可抑制血管钙化。二甲双胍是一种抗高血糖药,常用于治疗2型糖尿病,大量研究表明二甲双脈也具有由磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化介导的骨保护作用。近期研究结果表明,在体外实验中,二甲双胍由AMPK和内皮一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化介导抑制了 β-磷酸甘油诱导的动脉血管平滑肌细胞钙化。然而,二甲双胍是否对体内血管钙化有保护作用目前尚不清楚。在肿瘤研究中发现,二甲双胍的抗肿瘤作用与敲除Sp转录因子(Sp1、Sp3、Sp4)的作用相似,此外,二甲双胍还能够下调许多Sp转录因子的靶基因,如胰腺癌细胞中的VEGF,ErbB2和EZH2。这说明Sp1、Sp3、Sp4可能是二甲双胍的作用靶点。综上所述,本研究拟通过联用维生素D3和尼古丁来建立大鼠血管中膜钙化模型,模拟终末期肾病、糖尿病血管病变以及老化血管钙化,采用β-磷酸甘油建立血管平滑肌细胞钙化模型,观察Sp1在血管钙化中的作用,进一步干预Sp1验证其对血管钙化的影响并探究其作用机制,探究二甲双胍是否能够以Sp1为作用靶点发挥抗血管钙化作用,这一研究结果将为以Sp1为靶点防治血管钙化提供理论依据,也为二甲双胍应用于抗血管钙化提供了更多实验依据。本研究分为三部分进行:第一部分:Sp1在血管钙化平滑肌细胞表型转化中的作用及机制研究;第二部分:Sp1在血管钙化平滑肌细胞凋亡中的作用及机制研究;第三部分:二甲双胍对血管钙化的作用及机制第一部分:Sp1在血管钙化平滑肌细胞表型转化中的作用及机制研究研究目的1.明确血管钙化中Sp1表达水平是否发生变化;2.研究Sp1在体内和体外对钙盐沉积及ALP活性的影响;3.研究Sp1在体内和体外对血管平滑肌细胞表型转化的作用;4.探究Sp1对血管平滑肌细胞表型转化影响的作用机制。研究方法1.临床标本的收集研究对象入选标准:2015年在山东大学齐鲁医院就诊,被诊断为冠状动脉粥样硬化性心脏病,拟行冠状动脉旁路移植术(CABG)的患者,常规检查排除风湿、急性炎症性疾病与恶性肿瘤等系统疾病患者。术中收集废弃主动脉组织(n=4),一部分放入多聚甲酵固定,一部分放入液氮速冻保存。2.动物模型的建立维生素D3和尼古丁联用,以诱导模拟老化、终末期肾病和糖尿病血管病变的大鼠血管中膜钙化模型。大剂量维生素D3可以提高动脉组织的钙含量,尼古丁可使得维生素D3的作用增强。3.培养大鼠原代血管平滑肌细胞Wistar大鼠(150-200g)脱颈处死,浸入75%的酒精中5min;置入超净台内开胸取胸主动脉,去除血污、去除内膜与外膜,避免牵拉;剪碎中膜至1mm2大小的组织块;用移液管将组织块均匀贴于培养瓶底面,加含20%FBS的培养基2-3ml,将培养瓶倒置于5%CO2、37℃培养箱中,待2小时后正置培养瓶;5天后首次换液。4.大鼠原代平滑肌细胞的鉴定将提取的原代平滑肌细胞种植于细胞爬片上,密度为2×104/L;使用兔抗Alpha smooth muscle Actin抗体进行免疫荧光染色;共聚焦显微镜检测。5.血管平滑肌细胞钙化模型的建立采用10mM β-磷酸甘油(β-glycerophosphate,β-GP)刺激血管平滑肌细胞2-14天以诱导钙化。6.沉默Sp1腺病毒载体的构建构建干扰Sp1表达的腺病毒载体,以空载体作为对照(北京诺赛基因组研究中心有限公司);转染大鼠血管平滑肌细胞细胞(A7r5细胞)验证携带Sp1干扰序列的腺病毒的干扰效果。7.Sp1活性的抑制应用特异性Sp1活性抑制剂mithramycin(MTM)预处理血管平滑肌细胞1h后再应用β-GP刺激血管平滑肌细胞72h,进行后续实验。8.茜素红染色留取标本并制作石蜡切片,常规脱蜡水化后用茜素红S染液滴染。9.Sp1免疫组织化学染色留取标本并制作石蜡切片,常规脱蜡水化后使用抗Sp1抗体进行免疫组织化学染色。10.激光共聚焦显微镜检测应用细胞免疫荧光法检测血管平滑肌细胞中BMP2及a-SMA的表达情况。11.钙含量测定采用钙含量检测分析试剂盒据试剂盒说明检测组织及细胞钙含量。12.碱性磷酸酶活性测定采用碱性磷酸酶检测试剂盒据试剂盒说明检测组织及细胞碱性磷酸酶活性。13.蛋白印迹收集各组组织、细胞提取蛋白,分别检测Sp1蛋白表达水平的变化。14.逆转录PCR使用RNA提取试剂盒提取各组血管组织总RNA,进行逆转录和PCR、琼脂糖凝胶电泳检测血管平滑肌细胞中Sp1的mRNA表达水平。15.实时定量逆转录PCR使用RNA提取试剂盒根据说明书提取各组细胞总RNA,依次进行逆转录和实时定量PCR检测血管平滑肌细胞中Runx2、BMP2、a-SMA和Calponin的mRNA表达水平。16.双荧光素酶报告基因检测构建GV453-BMP2-LUC(全长,full length)和 GV453-B271-LUC(nt-241至30)报告基因载体;(2)将报告基因载体转染入血管平滑肌细胞后,给予β-GP诱导钙化并用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测并分析其荧光素酶活性,确定Sp1的作用靶点。17.染色质免疫沉淀准备细胞,超声波碎裂细胞DNA,进行染色质免疫沉淀,洗脱染色质并解交联,使用离心柱纯化DNA,聚合酶链反应(PCR)定量DNA。18.凝胶迁移实验构建生物素标记的BMP2启动子片段,及未标记的BMP2启动子片段作为冷竞争;提取细胞核蛋白;进行EMSA结合反应;6.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳;电转移并交联固定DNA;Streptavidin-HRP结合反应;ECL曝光并分析图像。19.统计学分析:计量资料变量以平均值±标准误差(mean±SEM)表示,以频数表示计数资料。采用Kolmogorov-Smirnov检验分析数据是否服从正态分布;采用方差分析、t检验(正态分布)或秩和检验(非正态分布)确定组间差异是否具有统计学意义。以上统计过程均借助SPSS v20.0统计软件完成,以p<0.05为差异是否具有统计学意义的检验标准。研究结果1.在人体和大鼠钙化血管组织中,Sp1表达水平均上调;2.构建干扰Sp1表达的腺病毒载体(Ad-Sp1),Ad-Sp1转染致Sp1蛋白表达较空载体组显著减少;3.与单纯钙化组相比,沉默Sp1或抑制Sp1活性可显著减少钙盐沉积、降低ALP活性;4.沉默Sp1显著减少血管中膜成骨标志物BMP2、Runx2表达、增加平滑肌标志物α-SMA、Calponin 表达;5.体外实验中,与单纯钙化组相比,沉默Sp1或抑制Sp1活性可显著减少成骨标志物BMP2、Runx2蛋白表达、增加平滑肌标志物α-SMA、Calponin蛋白表达;6.β-GP刺激组荧光素酶的表达水平显著高于正常对照组,BMP2启动子-241至30bp为Sp1结合位点;7.Sp1可以直接与BMP2的基因启动子DNA结合,促进其转录。研究结论1.人体及大鼠血管钙化组织中Sp1高表达;2.沉默Sp1或抑制Sp1活性能够能够减少血管组织及血管平滑肌细胞钙盐沉积,降低了ALP活性,抑制了血管平滑肌细胞向成骨表型转化,Sp1可能成为预防或治疗血管钙化的有效作用靶点。第二部分:Sp1在血管钙化平滑肌细胞凋亡中的作用及机制研究研究目的1.研究Sp1在血管钙化中对细胞凋亡的调控作用;2.探讨Sp1在血管钙化中对细胞凋亡的调控机制。研究方法1.动物模型的建立维生素D3和尼古丁联用,以诱导模拟老化、终末期肾病和糖尿病血管病变的大鼠血管中膜钙化模型。大剂量维生素D3可以提高动脉组织的钙含量,尼古丁可使得维生素D3的作用增强。2.血管平滑肌细胞钙化模型的建立采用10mM β-磷酸甘油(β-glycerophosphate,β-GP)刺激血管平滑肌细胞2-14天以诱导钙化,每三天换液。3.细胞凋亡的测定应用TUNEL凋亡检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒检测血管平滑肌细胞的凋亡情况。4.蛋白印迹收集各组细胞提取蛋白,分别检测Cleaved-caspase3和p53蛋白表达水平的变化。5.Caspase3活性的检测使用Caspase3活性检测试剂盒检测血管平滑肌细胞Caspase3活性。6.基质囊泡的检测收集经过处理后的血管平滑肌细胞上清,提取基质囊泡,重悬后进行蛋白质浓度测定,蛋白质浓度的变化反映了基质囊泡数量的多少。7.统计学分析:采用平均值±标准误差(mean±SEM)来表示计量资料变量,采用频数来表示计数资料。采用Kolmogorov-Smirnov检验分析数据是否服从正态分布;采用方差分析、t检验(正态分布)或秩和检验(非正态分布)明确组间差异是否具有统计学意义。以上统计过程均借助SPSS v20.0统计软件完成,以p<0.05为差异是否具有统计学意义的检验标准。研究结果1.沉默Sp1能够减少大鼠血管钙化引起的血管平滑肌细胞凋亡;2.沉默Sp1或抑制Sp1活性能够抑制β-GP导致的血管平滑肌细胞凋亡;3.沉默Sp1或抑制Sp1活性能够减少基质囊泡的释放;4.沉默Sp1能够下调cleaved-caspase3和p53的表达;5.抑制Sp1活性能够剂量依赖性的下调cleaved-caspase3和p53的表达;6.抑制Sp1活性能够抑制钙化的血管平滑肌细胞caspase3活性。研究结论1.沉默Sp1或抑制Sp1活性能够减轻血管钙化平滑肌细胞凋亡、减少血管平滑肌细胞基质囊泡的释放;2.促进平滑肌细胞凋亡、增加机制囊泡的释放可能是Sp1促钙化的另一作用机制;3.Sp1促进血管钙化平滑肌细胞凋亡、增加基质囊泡释放的作用可能是通过促进caspase3活化和上调p53的表达实现的。第三部分:二甲双胍对血管钙化的作用及机制研究研究目的1.建立大鼠血管钙化模型,明确二甲双脈对血管钙化的作用;2.探究二甲双胍对血管钙化影响的作用机制。研究方法1.动物模型的建立维生素D3和尼古丁联用,以诱导模拟老化、终末期肾病和糖尿病血管病变的大鼠血管中膜钙化模型。大剂量维生素D3可以提高动脉组织的钙含量,尼古丁可使得维生素D3的作用增强。2.茜素红染色留取标本并制作石蜡切片,常规脱蜡水化后用茜素红S染液滴染。3.Collagen Ⅰ免疫组织化学染色留取标本并制作石蜡切片,常规脱蜡水化后使用抗Collagen Ⅰ抗体行免疫组织化学染色。4.Sp1免疫组织化学染色留取标本并制作石蜡切片,常规脱蜡水化后使用抗Sp1抗体行免疫组织化学染色。5.钙含量测定采用钙含量检测分析试剂盒据试剂盒说明检测组织及细胞钙含量。6.碱性磷酸酶活性测定采用碱性磷酸酶检测试剂盒据试剂盒说明检测组织及细胞碱性磷酸酶活性。7.蛋白印迹收集各组组织提取蛋白,分别检测目的蛋白表达水平的变化。8.心脏功能的测定选取左室长轴标准切面留取心脏二维超声于M超图像测定左室收缩末期直径、左室舒张末期直径;并根据仪器自身内置的计算模块,计算出左室射血分数、左心室重量等。9.细胞凋亡的测定应用TUNEL凋亡检测试剂盒根据其说明书检测血管平滑肌细胞的凋亡情况。10.染色质免疫沉淀准备细胞,超声波碎裂细胞DNA,进行染色质免疫沉淀,洗脱染色质并解交联,使用离心柱纯化DNA,聚合酶链反应(PCR)定量DNA。11.统计学分析计量资料变量以平均值±标准误差(mean±SEM)表示,以频数表示计数资料。采用Kolmogorov-Smirnov检验分析数据是否服从正态分布;采用方差分析、t检验(正态分布)或秩和检验(非正态分布)确定组间差异是否具有统计学意义。以上统计过程均借助SPSS v20.0统计软件完成,以p<0.05为差异是否具有统计学意义的检验标准。研究结果1.实验末大鼠基本情况:二甲双胍组收缩压和舒张压较钙化组下降,而心率、脉压、体重在各组间无显著差异。心脏超声结果显示钙化组LVIDd和LVIDs与正常对照组相比显著减小,LVPWd和LVmass/BW显著增大,提示血管钙化模型大鼠出现了左室肥大;经二甲双胍治疗后,LVIDd和LVIDs增大,LVPWd和LVmass/BW减小,提示二甲双胍有利于维持血管钙化模型大鼠正常的心脏结构、减缓心室重构;2.二甲双胍能够抑制尼古丁和维生素D3联合诱导的血管钙化;3.二甲双胍处理4周后,与钙化组相比AMPK磷酸化水平、eNOS磷酸化水平明显上调,同时,TGF-β1蛋白表达水平和Smad2/3磷酸化水平明显下调;4.二甲双胍可抑制血管钙化时Sp1的高表达,并减弱Sp1与BMP2启动子的亲和力。研究结论1.二甲双胍具有抑制血管钙化的作用;2.二甲双胍通过抑制VSMCs表型转换,减轻弹性纤维异常降解、胶原沉积和抑制VSMCs凋亡来发挥抗血管钙化作用;3.二甲双胍抗血管钙化作用可能是由AMPK-eNOS/TGF-β信号通路介导的;4.二甲双胍能够抑制大鼠血管钙化模型中Sp1表达和与BMP2启动子的亲和力,Sp1可能是二甲双胍的潜在作用靶点。