论文部分内容阅读
目的:探讨类风湿关节炎(RA)患者T细胞中高表达的Mi R-128-3p在RA发病机制中的作用。方法:1、首先收集诊断符合《2010ACR/EULAR类风湿关节炎分类标准》的RA患者20例作为研究对象。同时,随机选取健康志愿者20例作为对照组。中位年龄43岁。抽取两组等量外周静脉血5ml作为新鲜抗凝血样品。RA患者取样时保证间隔末次服药时间12h以上以减少药物对于本次研究结果的干扰。2、采用流式细胞术法分离出血清中的T细胞,并用含有PMA/离子酶素的培养基培养T细胞18小时后,分别检测CD69和CD25的表达;3、实时PCR法检测试验组和对照组血清中T细胞中的Mi R-128-3p表达水平;Western印迹法检测试验组和对照组血清中肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(TNFAIP3)表达水平;ELISA检测试验组和对照组血清中IL-6、IL-17表达水平,并比较。4、计算机启动子分析和预测算法:使用公共数据库计算机启动子分析来预测Mi R-128-3p靶基因结合序列,并合成TNFAIP3的3’-UTR,其中含有Mi R-128-3p结合位点。另外在Mi R-128-3p结合位点内随机选取几个位点突变构成TNFAIP3突变型,以便作对照研究。荧光素酶报告基因检测法证实,Mi R-128-3p可结合于TNFAIP3的编码基因3’-UTR端。5、使用Lipofectamine 2000,用100n M合成的pre-Mi R-128-3p或pre-Mi R-128-3p阴性对照(Pre-Mi R Mi RNA前体分子和Pre-Mi R Mi RNA前体阴性)转染HEΚ293 T细胞。并在两组中分别加入Mi R-128-3p的模拟物和Mi R-128-3p抑制剂各100 nmol/l。再次测定荧光酶活性。6、流式细胞术法检测CD69、CD25表达水平。Western印迹法检测p-IκBα表达水平。7、建立RA小鼠模型,为了进一步确定Mi R-128-3p在体内对RA的作用机制,将小鼠分为两组(每组n=6):阴性对照和Mi R-128-3p抑制剂组。用计算小鼠后足的RA评分来评估关节炎的炎症水平。结果:(1)在RA患者血清样本中,提取出的T细胞内的Mi R-128-3p表达水平明显增加而TNFAIP3表达水平明显减少。(2)提取出的T细胞内的RA患者血清中IL-6、IL-17表达水平较健康者血清中的IL-6、IL-17表达水平增加。(3)通过荧光素酶报告基因检测证实,Mi R-128-3p可结合于TNFAIP3的编码基因3’-UTR端。(4)加入Mi R-128-3p抑制剂,Mi R-128-3p表达水平减低后,TNFAIP3表达水平明显增加。(5)下调Mi R-128-3p表达水平,p-IκBα表达水平显著下降,T细胞的CD69/CD25比值明显下降,提示T细胞受到抑制。下调TNFAIP3表达水平可以反转抑制Mi R-128-3p表达所得到的效果。(6)Mi R-128-3p抑制剂组的RA小鼠模型相比对照组,RA评分较低,关节炎症状较轻。结论:为了进一步阐明RA患者T细胞中异常表达的Mi R-128-3p在RA发病机制中的作用,在本次的研究中,我们比较了来自RA患者和健康者志愿者T细胞中Mi R-128-3p的表达水平,发现在RA患者T细胞中Mi R-128-3p高表达。接着,我们进一步研究了高表达的Mi R-128-3p究竟是如何发挥作用。通过荧光酶报告基因检测法证明Mi R-128-3p可结合于TNFAIP3编码基因的3’-UTR端,在转录后水平抑制TNFAIP3表达,已知TNFAIP3是NF-κB信号传导途径的重要负性调控分子,从而促进了NF-κB信号转导途径和T细胞的活性。结合构造的RA小鼠模型,从体内验证了Mi R-128-3p为RA中的促炎因子的猜想,Mi R-128-3p在RA中致病的作用机制得以揭示。