自由基在机体内普遍存在，并且依赖抗氧化防御系统维持一种动态的平衡。抗氧化防御系统中的抗氧化剂分为酶类和非酶类两种，其中酶类抗氧化剂，即抗氧化酶发挥主要的作用。当机体发生某些疾病时，抗氧化防御系统中的抗氧化剂不能满足机体需要时，外源性抗氧化剂成为防治疾病的一类药物。但提取天然抗氧化酶作为药物成本高、来源有限，且天然酶还有分子量大、稳定性差等缺陷，限制了其应用。因此制备抗氧化模拟酶就成为获取外源性抗氧化剂的一种重要策略。谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）是一种能够催化多种自由基分解的抗氧化酶，它在维持机体内氧化还原平衡过程中发挥重要作用，从而减少自由基对机体的损伤。GPx是一种含硒酶，同时研究发现机体内大部分含硒蛋白均具有抗氧化活性。因此，硒蛋白作为保护性治疗氧化应激相关疾病的药物越来越受关注。目前，制备硒蛋白的方法有化学合成、化学修饰、半胱氨酸缺陷表达和硒代半胱氨酸通读表达等方法。其中后二者属于基因工程方法，是近年来研究的热点。开发一种成本低、工艺简单，且具有较高抗氧化活性的含硒模拟酶，不仅可以获得更多潜在的抗氧化药物，也有助于研究机体天然抗氧化酶的催化作用机制。本研究的主要目的就是探索和优化硒蛋白的制备方法，制备具有一定抗氧化活性的硒蛋白，并在亚细胞和细胞水平研究硒蛋白的抗氧化作用。主要开展了以下工作：利用生物信息学方法和计算机辅助分子设计方法对人源性scFv进行3D建模，并再用计算机模拟筛选与GSH结合力较高的人源性scFv，获得Se-scFv-WCD1模型。将scFv-WCD1基因序列克隆到表达载体pET22b(+)上，用E. coli BL21(DE3)进行可溶性表达后，通过Ni2+螯合的固定化金属亲和层析（IMAC）纯化获得了scFv-WCD1蛋白。化学修饰法制备Se-scFv-WCD1并鉴定其酶学性质。Se-scFv-WCD1具有较高的GPx活性，其反应动力学为典型的乒乓机制。人源性Se-scFv-WCD1的成功制备，节省了噬菌体库多轮筛选的成本，说明计算机虚拟筛选结合化学修饰法制备含硒抗氧化模拟酶的策略是可以广泛适用的。应用SPP系统联合化学修饰法制备了Se-scFv-WCD1-lessACA。在表达阶段，SPP系统的成功应用，直接表达出较纯的scFv-WCD1-lessACA蛋白，省略了蛋白质的纯化过程。这节约了大量用于蛋白纯化的实验材料以及所需的时间。通过酶学性质鉴定证明，利用SPP系统联合化学修饰法制备的Se-scFv-WCD1-lessACA与以往实验中按常规方法制备的Se-scFv-WCD1表现出相同的酶学活性，如GPx活性、GSH结合常数、最适pH值、最适温度和酶反应动力学常数等。此外，Se-scFv-WCD1-lessACA具有较强的抗氧化活性，可以保护Fe2+/VC对线粒体的损伤。这为硒蛋白的制备和新型抗氧化药物的开发提供了技术支持。利用SPP系统联合Cys缺陷表达技术制备了具有SOD和GPx双酶活性的含硒65肽。Se-CuZn-65P是本研究组以前的研究中根据天然SOD3的同源序列同一段具有GPx活性的15连接而成，它在Xanthine/XOD/Fe2+损伤模型中显示出高SOD和GPx活性。而在SPP系统中利用Cys缺陷表达技术制备的Se-CuZn-65P也具有较高的SOD和GPx活性。通过Tricine-SDS-PAGE电泳、RP-HPLC和MALDI-TOF MS的实验结果证明这中硒蛋白的制备策略可以成功地获得较高纯度的Se-CuZn-65P。同时，本课题组利用乙醇诱导的L02细胞建立了酒精肝细胞损伤模型来鉴定其抗氧化活性。细胞增殖实验结果表明Se-CuZn-65P不仅几乎没有细胞毒性，而且能提高乙醇诱导损伤L02细胞存活率、迁移率等。TUNEL和FCM实验证明Se-CuZn-65P还能抑制乙醇诱导的L02细胞凋亡，主要表现在抑制细胞核形态学上的损伤。其抑制机制可能是Se-CuZn-65P降低乙醇引起的氧化损伤，从而降低了促凋亡基因与抗凋亡基因的比率，减少了细胞凋亡线粒体途径中Procaspase-3和PARP蛋白的切割。综上所述，Se-CuZn-65P对乙醇诱导的L02细胞损伤有保护作用，并可能成为一种潜在的预防ALD的药物。