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肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是儿童常见的社区获得性肺炎(Community acquired pneumonia,CAP)的主要病原体,可引起非典型性肺炎及一系列并发症。本研究旨在从临床样本中分离培养MP菌株,并从中筛选保护力强和安全性好的MP分离株作为疫苗候选株,为人用肺炎支原体疫苗的研制奠定基础。本研究通过比较不同培养基及添加物对MP生长速度及CCU的影响筛选培养基;再添加不同抗生素及采用滤膜过滤等几种预处理方法去除杂菌,对富集时间进行摸索以建立肺炎支原体分离培养方法。结果发现以含20%马血清作为添加物时,0.5%葡萄糖的SP-4培养基可使MP生长速度快,菌量多;再加入终浓度为500 U/mL青霉素G,2.5 U/mL多粘菌素B,2.5μg/mL两性霉素及0.0025%醋酸铊时能有效抑制杂菌生长但不会明显抑制支原体的生长;后依次采用0.45 μm及0.22 μm孔径滤膜过滤可去除大部分杂菌;咽拭子、痰样本的富集时间分别为6-8 h及18-24 h分离效果最好。本研究最终从689个儿童咽拭子及痰样本中分离到了 30株人肺炎支原体菌株,经过RFLP方法分型,确定其中25株为I型,5株为II型。为了筛选免疫原性好、毒力低的MP分离株,对所有分离株的主要抗原基因(p1、p30、p65)及毒力相关基因(cards、mpn491)进行测序比对,选取11株代表菌株连续2 d以108 CCU/mL(×100μL滴鼻感染Balb/c小鼠测其致病性,以107 CCU/mL(×100μL)滴鼻免疫Balb/c小鼠1次,21 d后用108 CCU/mL(×100μL)同型别标准株攻毒,从湿重肺指数、肺组织病理学评分角度分析MP分离株的致病能力及保护力。致病性实验发现14号分离株致病性最弱,小鼠体重变化率分别为5.73±1.17%,湿重肺指数分别为0.93±0.10%;21号、27号分离株致病性最强,小鼠体重变化率分别为-16.95±4.02%;-14.76±11.31%,湿重肺指数分别为1.44±0.06%;1.46±0.11%;肺组织病理学评分为12±7;12±2,二者间无统计学差异(P>0.05)。并且综合实验结果发现滴鼻免疫后II型分离株保护效果好于I型分离株,其中利用14号分离株免疫并用FH株攻毒后小鼠湿重肺指数为0.71±0.07%、肺组织病理学评分为3±1,明显好于阳性对照组,与阴性对照组无统计学差异(P>0.05),显示其保护效果最好。本研究建立了从临床标本中分离培养MP菌株的方法,并成功分离到30株MP菌株,其中14号分离株致病性最弱、保护力最好,21号、27号分离株致病性最强,本研究可为人用肺炎支原体疫苗候选株的选择奠定基础,对该疫苗的研制具有重要的应用价值。