背景与目的卵巢恶性肿瘤为女性生殖器官常见恶性肿瘤之一,近年来,发病率呈上升趋势。由于发病初期患者常无明显症状,70%的患者就诊时已属晚期,70%不能治愈,死亡率居高不下,五年生存率一直徘徊在25%-30%左右。浆液性囊腺癌占卵巢恶性肿瘤的40%左右,易腹腔转移,预后差,其恶性行为严重影响了病患的治疗及预后,究其根本,在于目前未能找到有效的早期筛查手段,对卵巢癌发生发展的分子机制仍不完全清楚,针对卵巢癌分子层面的诊治仍是目前基础肿瘤学研究中的重点、难点及热点。本课题组以病人的高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)组织及病人正常的输卵管伞端(FT)组织(正常对照)为样本,利用高通量蛋白质组学和组织芯片等技术,进行蛋白质分子网络分析和临床信息的系统集成,发现了 Rad50、CD47两个分子在癌组织中的表达量均远高于伞组织中的表达量。Rad50是DNA损伤修复蛋白,它与MRE11、NBS1组成MRN复合物,此复合物在DNA双链损伤修复、同源和非同源重组、细胞检验点激活、端粒长度维持、保证DNA复制的顺利进行以及维持基因组的稳定性等方面都起到了重要的作用。口前了解到的DNA损伤修复蛋白大多发挥抑癌基因的作用,如p53、BRAC1等基因的突变在浆液性卵巢癌的发生发展中发挥了重要作用,而越来越多的文献也报道出恶性肿瘤中DNA损伤修复蛋白呈现高表达状态且具有促进肿瘤细胞转移的作用,并与预后息息相关,如黑色素瘤中,许多DNA修复通路中的蛋白呈现高表达状态并可促进黑色素瘤转移。因此课题组猜想,Rad50或许也与浆液性卵巢癌的生长和转移有关联,并影响患者预后。这将为卵巢癌的研究提供新的思路。CD47是经典的抗巨噬细胞吞噬的跨膜蛋白,巨噬细胞上的SIRPa蛋白可以与其结合,从而触发一系列信号反应而导致吞噬被抑制。除了免疫逃逸的作用,CD47对于细胞增殖凋亡粘附转移等过程中的作用也有研究。本课题也基于此对CD47对卵巢癌恶性行为的影响进行探讨。本课题主要探讨Rad50、CD47在HGSOC发生发展中的作用并利用体内体外实验研究其发挥作用的机制,而目前国内外尚未发现此方面的研究报道。本文针对课题的研究内容主要从以下三部分展开阐述:一、DNA损伤修复蛋白Rad50促进卵巢癌细胞生长增殖的机制研究二、DNA损伤修复蛋白Rad50促进卵巢癌转移的分子机制研究三、CD47在卵巢癌发生发展中的作用及机制研究第一部分:DNA损伤修复蛋白Rad50促进卵巢癌细胞生长增殖的机制研究背景和目的:卵巢癌是威胁全世界女性健康的恶性肿瘤之一,尤其是高级别浆液性卵巢癌(HGSOC),具有非常恶劣的生物学行为,其发生发展规律及机制一直是目前研究的热点,对其机制的研究有利于找到有效的治疗方法,改善患者预后。卵巢癌越来越被认为是基因型疾病,研究者发现了许多在其发生发展过程中发挥重要作用的分子。本课题研究的分子Rad50,便是与其耐药性息息相关的一个DNA损伤修复蛋白。但是迄今为止鲜有研究报道Rad50在HGSOC的发生发展过程中扮演的其他角色。此项研究的目的就是通过对临床标本的分析,研究其与HGSOC预后的关系,并调节卵巢癌细胞中Rad50的表达水平,利用细胞生物学实验观察其改变后,卵巢癌细胞生长增殖能力是否受到影响,并探究相应机制。材料和方法:收集HGSOC标本,以正常FT组织为对照,利用Western Blot等检测二者之中Rad50表达量差异。选取合适的卵巢癌细胞系,利用慢病毒包装感染体系过表达或敲除其RAD50基因,构建起后续使用的细胞系。随后进行细胞功能学实验以研究Rad50表达改变后,卵巢癌细胞发生的一系列生物学功能的变化。包括:利用MTT及单克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验等检测Rad50对细胞增殖速度、克隆形成率的影响。利用流式细胞仪检测分析细胞周期分布及凋亡率改变等。进而根据其对细胞生物学功能的影响,对应做出机制研究,比如利用WB检测细胞周期相关蛋白(p21Cipl,p27Kipl,Cyclin D1等)表达的改变情况。最后本课题组还将稳筛成功的过表达组及干扰组细胞分别接种于裸鼠皮下,观察并比较各组裸鼠成瘤时间,成瘤大小,生长速度及最终的质量,记录裸鼠生物学行为的改变,探讨Rad50对于裸鼠致瘤能力的影响。结果:Rad50在HGSOC中的表达高于正常对照且与HGSOC病人的预后相关:生存分析示Rad50高表达组较低表达组预后明显较差,Rad50的表达还与肿瘤的淋巴结转移及大网膜转移相关。过表达Rad50后,卵巢癌细胞的增殖能力明显增强:MTT法示细胞生长速度增加、平板克隆形成和软琼脂克隆形成实验示细胞克隆形成率增加,敲除之后结果相反。Rad50表达改变可影响卵巢癌细胞的周期分布而不影响凋亡:利用流式细胞术研究组检测了 PI染色的细胞周期改变,发现Rad50敲除会引起SKOV3细胞系G0/G1期的阻滞,A2780细胞系G0/G1,S期阻滞,同时WB检测p21Cip1和p27Kip1表达增加,该结果解释了细胞增殖能力的急剧下降。Rad50改变后,细胞的凋亡情况未发生变化。体内实验也同样证明Rad50敲除卵巢癌细胞系的成瘤能力下降,而过表达细胞系成瘤能力明显增强。作为补充,本课题还验证了 Rad50对卵巢癌顺铂耐药现象的影响。结论:DNA损伤修复蛋白Rad50可以促进卵巢癌细胞生长增殖,发挥原癌基因作用并与卵巢癌预后相关。第二部分:DNA损伤修复蛋白Rad50促进卵巢癌转移的分子机制研究背景和目的:卵巢癌致死率极高、预后差,这不仅仅源于其对药物的原发性或继发性耐药,还更因为癌细胞侵袭能力强、易转移,常常广泛播散于盆腔及腹腔致使手术治疗不彻底。上皮间质转化(EMT)现象在肿瘤的转移过程中扮演重要角色。EMT过程受多条通路的调控,NF-κB通路就是其中非常重要的的一条通路。研究发现DNA修复蛋白Rad50可通过与CARD9结合激活NF-κB通路。本部分研究的目的即是验证Rad50对卵巢癌侵袭转移能力的影响并探讨相关机制。将DNA修复蛋白与卵巢癌的浸润转移联系起来是本课题组工作的重点及创新点,而目前也已经有过关于DNA修复蛋白参与肿瘤浸润转移的报道,如黑色素瘤中就有许多DNA修复通路中的蛋白呈现高表达状态并可促进肿瘤转移。基于前期文献的报道验证,本课题组相信此课题虽然有一定的挑战性,但仍有理可据,有一定的可行性。材料和方法:继续利用第一部分工作中建立起的稳定的细胞系。通过Transwell实验计数穿越至下壁细胞的数量,检测比较Rad50过表达组细胞,干扰组细胞及其相应对照组细胞转移能力的改变。Western blot方法检测EMT相关标志分子的变化情况,建立Rad50改变与EMT的关联。WB、免疫荧光方法检测NF-κB通路改变情况,并且用胞浆胞核分离法分离细胞蛋白进一步验证NF-κB成分的入核情况,用NF-κB的抑制剂PDTC抑制此通路后再将Rad50过表达,观察细胞功能变化,进一步验证NF-κB通路在Rad50对卵巢癌细胞影响中的作用。利用免疫共沉淀(Co-IP)的方法检测Rad50与CARD9在卵巢癌细胞中的相互结合,并干扰掉CARD9以验证Rad50对NF-κB通路的激活依赖CARD9。最后,利用裸鼠腹腔注射及尾静脉注射癌细胞验证Rad50对卵巢癌细胞的腹腔内转移及肺转移的影响。结果:Transwell实验证明Rad50改变可影响卵巢癌细胞的迁移侵袭能力:过表达后细胞转移能力增强,而敲除后细胞转移能力明显减弱。Rad50过表达后卵巢癌细胞形态更趋向于纤维细胞,敲除后则更类似上皮细胞形态。课题组验证了Rad50可通过调节EMT相关分子诱导卵巢癌细胞发生EMT改变进而影响转移能力。WB,免疫荧光实验结果示Rad50的过表达可促进NF-κB活性分子的入核以致该通路的激活,进而调控EMT相关分子的改变,从而诱导细胞发生EMT。用PDTC抑制NF-κB通路,再次过表达Rad50后,细胞的转移能力不再增加,EMT相关分子不再明显改变。利用Co-IP的方法检测了 Rad50与CARD9在卵巢癌细胞中可相互结合,而干扰掉CARD9会影响Rad50对转移的促进作用。最后通过体内实验进一步证实了 Rad50过表达可促进卵巢癌细胞的在裸鼠中的腹腔转移及肺转移,敲除则相反。结论:卵巢癌细胞中Rad50的过表达可通过结合CARD9而激活NF-κB通路,进而调节了 EMT相关分子的变化,从而诱导细胞发生EMT改变,最终导致了细胞侵袭迁移能力的极大增强。Rad50敲除时,与之相反。该论文第一二部分重点研究了 Rad50对卵巢癌细胞的生物学行为包括生长增殖转移等的影响,并探讨了其发挥作用的机制。创新点主要体现在以下几方面:1.突破对Rad50的传统的关于DNA损伤修复机制及耐药方面的研究,转为探讨Rad50对卵巢癌细胞的生物学行为的影响,对Rad50的原癌基因功能做出了基础的验证;2.首次研究了 DNA修复蛋白Rad50在卵巢癌中促生长增殖的作用,拓宽了 DNA修复蛋白的作用范围,为DNA修复蛋白提供了新的研究思路;3.首次提出Rad50促进卵巢癌转移的作用,并将Rad50与EMT相关联,为其促进转移提供了可靠的依据;4.首次研究了 Rad50促转移的分子机制,其在卵巢癌中可以结合CARD9以激活NF-κB通路,从而影响EMT相关蛋白的表达。这也为Rad50的进一步研究提供了方向;5.首次通过体内实验验证了 Rad50对裸鼠皮下成瘤、腹腔种植瘤转移及卵巢癌细胞肺转移能力的影响。第三部分:CD47在卵巢癌发生发展中的作用及机制研究背景和目的:CD47在癌细胞中发挥抗吞噬信号的作用,可以阻止巨噬细胞对癌细胞吞噬。CD47在多种恶性肿瘤中呈现高表达状态。本课题以CD47在HGSOC中的表达及意义展开研究,并验证CD47表达改变对卵巢癌细胞恶性行为的影响,为卵巢癌早期筛查寻找特异性分子,为其治疗提供有效的治疗靶点。材料和方法:利用收集的HGSOC和FT标本以及卵巢癌细胞系和正常相关细胞系,进行qRT-PCR、WB、免疫组化(IHC)等方法检测CD47的表达情况。选取A280细胞,利用慢病毒包装感染体系过表达CD47基因,构建起稳定细胞系;选取A2780和SKOV3利用瞬时转染siRNA干扰细胞中CD47的表达。随后进行细胞功能学实验以研究CD47表达改变后,卵巢癌细胞的一系列生物学功能的变化。包括:利用平板克隆形成实验检测细胞增殖的改变。利用流式细胞仪检测分析细胞周期分布改变等。利用Transwell,检测细胞转移能力的改变。进而对应做出机制研究:利用WB和免疫荧光染色检测细胞EMT相关蛋白表达的改变情况。结果:CD47在增生性输卵管上皮细胞中表达增加,在同一个FT标本中发现,多层上皮细胞中CD47的染色强于单层上皮细胞。在mRNA和蛋白水平上,CD47在HGSOC的表达均高于FT。生存曲线示CD47高表达组病人较低表达组预后明显较差,CD47的表达还与血清中CA125的高浓度相关。Transwell示CD47表达增加明显促进卵巢癌细胞的转移能力,且细胞中EMT标志分子相应发生变化,敲除之后结果相反。CD47表达改变不影响卵巢癌细胞生长增殖和周期分布。结论:CD47或许可以成为FT上皮细胞增生病变的标志,成为HGSOC有效的预后分子。CD47可影响卵巢癌细胞EMT标志分子的改变诱导细胞发生EMT的变化,从而促进细胞的转移。CD47不影响EOC细胞的生长增殖和周期调控。