禾谷镰刀菌随机插入突变体的构建及其水杨酸代谢途径关键基因鉴定

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赤霉病是小麦的重要病害之一,其主要致病菌是禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)。目前禾谷镰刀菌诱发赤霉病的机理尚不清楚。对禾谷镰刀菌的功能基因进行研究,有助于科学认识禾谷镰刀菌的致病机理,为赤霉病的防治奠定分子基础。为此本文主要做了以下研究:1.利用农杆菌介导的遗传转化体系构建禾谷镰刀菌的T-DNA随机插入突变体。通过对转化体系进行优化,每转化106个分生孢子得到70-80个T-DNA随机插入突变体。经分离纯化,得到了365个潮霉素抗性为阳性的突变单株。在SNA培养基上鉴定突变单株的生长状况,在含水杨酸的SNA培养基上鉴定其生长状况,在温室接种小麦鉴定其致病力。结果得到6株突变体在普通SNA培养基上生长缓慢;8株在普通SNA培养基上生长产生的色素减少;3株对水杨酸敏感,在含2.0 mM水杨酸的SNA培养基中无法生长;2株在温室接种小麦后致病力明显下降。其中,AMa334在普通SNA培养基上同时表现为生长缓慢和菌落白化,△Ma208同时表现为在普通SNA培养基上生长缓慢和在含2.0 mM水杨酸的SNA培养基中无法生长,AMa39则同时表现为在普通SNA培养基上生长缓慢和接种小麦后致病力明显下降。对以上16株突变体基因组进行PCR,结果表明这16株突变体单株均含有潮霉素抗性基因(HPH)序列。以T-DNA右翼序列设计的3个嵌套引物和2个简并引物对这些突变体基因组进行巢氏PCR (TAIL-PCR),对扩增得到DNA片段进行克隆测序。得到4个突变体的T-DNA侧翼序列。将这些侧翼序列与禾谷镰刀菌的基因组序列进行比对,获得了如下信息:T-DNA在AMa39的插入位点位于禾谷镰刀菌supercontig 3.4的542464 bp处,位于基因FGSG06605.3的中间。该基因可能编码p-葡萄糖苷酶的前体蛋白,与葡萄糖的分解相关。T-DNA的插入可能使基因FGSG06605.3无法正常表达,导致△Ma39在普通SNA培养基中生长缓慢,及接种小麦麦穗后致病力明显下降。T-DNA在△Ma247的插入位点位于禾谷镰刀菌supercontig 3.6的1547302 bp处,位于基因FGSG13581.3的中间。该基因编码一个未知蛋白,T-DNA的插入可能使基因FGSG 13581.3无法正常表达,导致△Ma247在普通SNA培养基中生长时菌落白化。T-DNA在△Ma256的插入位点位于禾谷镰刀菌supercontig 3.3的2133337bp处,位于FGSG12730.3上游819 bp处和FGSG05397.3上游1339bp处。这两个基因编码的均为未知蛋白。T-DNA的插入可能使FGSG12730.3和FGSG05397.3无法正常表达,导致△Ma256在普通SNA培养基中生长时菌落白化。T-DNA在AMa319的插入位点位于禾谷镰刀菌supercontig 3.6的1360744bp处,位于基因FGSG09387.3的下游。根据Blastx的结果,该插入位点位于一个非典型蛋白中间,可能使该蛋白不能正常表达,从而导致AMa319在普通SNA培养基上生长缓慢。2.以葡萄糖为唯一碳源的改良SNA培养基为对照,以水杨酸为唯一碳源的改良SNA培养基培养禾谷镰刀菌Fg180378。提取菌丝mRNA,利用转录组测序(RNA-Seq)技术检测基因表达。结果表明,有173个基因的表达存在显著差异。其中86个基因上调表达,87个基因下调表达。与之前的研究比较,进一步验证了FGSG09063在水杨酸代谢过程中的重要性;发现了一些与芳香烃代谢相关基因的表达存在显著差异,这些基因可能与水杨酸代谢相关。在所有的差异基因中,上调表达倍数最高的几个基因的功能尚不明确。由于目前缺乏水杨酸代谢的深入研究,很多机制还不明确,这些基因可能与之相关,这些将是下一步的研究内容。
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