诱导多潜能(induced pluripotent stem,iPS)干细胞是通过在分化的体细胞中表达特定的几个转录因子,以诱导体细胞重编程而获得的可不断自我更新且具有多向分化潜能的细胞。由于iPS细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物和形成畸胎瘤等方面与胚胎干细胞非常相似,具有避免免疫反应又不涉及伦理道德问题等优势,因此具有广泛且重要的临床应用价值,同时可以利用该技术培育出以前以传统方法从动物胚胎中获取胚胎干细胞没有成功的模式动物或重要经济动物的胚胎干细胞,这样可以对其进行成功的基因改造或遗传育种工作。　　 小鼠和大鼠iPS细胞系已经建立,并已运用于人类疾病模型的研究中,但是小鼠和大鼠的体型大小,生理学特性以及寿命都与人类有很大差异。相对而言,猪在解剖、生理、生化代谢等方面与人的更为近似,建立猪的iPS细胞系更有利于研究人类的疾病机制和建立有效的治疗模式。　　 猪用作医学实验动物近年来呈越来越普遍的趋势,尤其是各种小型猪品系的建立,促进了这方面的发展与应用。转基因克隆技术的运用更增加了以猪作为人类疾病模型的应用；以小型猪为材料,应用转基因技术制备转基因猪人类疾病动物模型,具有广阔应用前景。南方医科大学实验动物中心顾为望教授等人于2004年由西藏自治区将藏猪引种至广州,并进行风土驯化,经5年培育而成了的新的小型猪品种,并将其命名为西藏小型猪(Tibet minipig)。同时对西藏小型猪生理生化、生产繁殖性能、基因多态性等生物学特性方面进行了较为系统的研究,是国内公认的实验用小型猪品种。　　 鉴于此,本实验拟通过(1)建立基于PEFs建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统技术,以为下一步利用借助慢病毒载体法将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种基因导入西藏小型猪胚胎成纤维细胞提供技术保障；(2)构建携带Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因高效率感染PEFs的病毒载体,进而将其在体外诱导为iPS细胞,从而建立西藏小型猪的iPS细胞系奠定基础。　　 1.慢病毒介导的外源基因体外投递系统的建立　　 方法:取35天西藏小型猪胚胎,酶消化法分离培养西藏小型猪的PEFs；按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒(携带EGFP基因)包装(脂质体介导的瞬时转染),随后用病毒上清感染PEFs,24～48 h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功生产和成功感染PEFs。　　 结果:成功分离培养西藏小型猪的PEFs,按标准程序生产的携带EGFP基因慢病毒高效率感染西藏小型猪的PEFs。　　 2.携带人Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的慢病毒表达载体构建。　　 方法:以pLenti-EF1a-X-IRES-EGFP(X:分别代表Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)质粒为模板,PCR扩增目的基因(2.35Kbp、2.55Kbp、2.7Kbp、2.8Kbp),克隆至pFUGW载体中。连接产物转化,次日挑选单菌落,提取质粒并行酶切鉴定。所构建载体命名为pFUXGW(X:分别代表Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)。获pFUXGW后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产；携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和EGFP基因的慢病毒感染293FT细胞和PEFs以建立相应病毒感染体系。　　 结果:酶切鉴定证实成功构建了pFUXGW(X:分别代表Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc),按标准程序生产的携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和EGFP基因的慢病毒上清高效率感染:PEFs。　　 3 重编程西藏小型猪胎儿成纤维细胞　　 方法:用慢病毒上清感染PEFs,48h后弃病毒感染液,更换人ES细胞培基,之后每天更换培基直到第二十天克降足够大时挑取克降扩大培养,AKP染色生物学特性鉴定。　　 结果:病毒感染PEFs后,细胞形态发生变化,于第7天即可见克隆样形态出现,第16天挑取克隆,扩大培养。第18天,PEFs细胞AKP检测均为阴性。　　 4 结论　　 4.1西藏小型猪是新型实验动物,本实验成功培养出西藏小型猪胚胎成纤维细胞,为建立西藏小型猪诱导多能干细胞系提供了材料,同时也为转基因体细胞核移植技术制备转基因西藏小型猪的克隆猪提供核供体。　　 4.2针对西藏小型猪胎儿成纤维细胞成功建立了慢病毒介导的体外感染体系,为接下来借助慢病毒将不同目的基因导入西藏小型猪的PEFs奠定了基础。携带外源基因的PEFs提供的细胞核可利用转基因体细胞核移植技术制备转基因克隆西藏小型猪,进而基于它建立相应的人类疾病模型动物模型。　　 4.3成功构建携带Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因高效率感染PEFs的病毒载体,为建立西藏小型猪的iPS细胞系奠定基础。