穿心莲 Andrographis paniculata(Burm.f.)Nees 为爵床科(Acanthaceae)穿心莲属(Andrographis)—年生的草本植物,以地上部分入药,是2015版《中华人民共和国药典》(一部)收载的品种。其性寒、味苦;具有抗肿瘤、清热解毒、消炎抗菌、利胆保肝、消肿止痛等功效,临床常用于治疗疟疾、蛇虫咬伤、糖尿病以及高血压等疾病。主要化学成分为二萜内酯类化合物,具有广谱的抗菌、抗病毒等作用,素有“天然抗生素”之称。主要分布于热带和亚热带地区,我国最早于20世纪50年代在福建、广东、广西进行引种栽培,目前在我国、印度、泰国、马来西亚等国的传统医学系统中有非常广泛的应用。目的:由于受到产地环境、种植质量、栽培条件及采收加工等因素影响,造成了不同产地的穿心莲主要成分含量差异较大,药材的质量参差不齐,同时各地的种植栽培量逐年下降,各地穿心莲供不应求,并且由于穿心莲闭花受精的生物学特性阻碍了群体内遗传多样性的发生,因此也对穿心莲的良种选育提出了迫切的需求,而化学诱变育种培育在生产上的推广和应用,已获得了显著的经济利益和社会效益。本研究以开展药用植物相关的育种研究提供新的研究方向和思路,并且为选育优良耐贮的新品种,增加穿心莲产量奠定理论基础为目的进行生理响应的研究。方法:本研究以3种化学诱变剂(氨磺乐灵、甲基磺酸乙酯(EMS)、秋水仙素)诱导的穿心莲种子为材料,在建立相关诱导条件的基础上,应用植物生理学、生物化学和分子生物学等多学科知识进行实验研究。1.以穿心莲种子为材料,通过采用3种不同浓度的化学诱变剂诱导,比较诱导对穿心莲种子萌发的影响,研究它们对于穿心莲种子的出根和萌芽的差别,以及根长、苗高的影响变化。2.跟踪诱导后穿心莲的生长情况,研究穿心莲植株的生长发育过程中物候时间、形态特征的变化,以及四倍体和二倍体植株性状特征的对比情况分析。3.采用相关的化学研究方法,分别研究化学诱变后生长过程中穿心莲植株可溶性糖、可溶性蛋白、叶绿素、丙二醛等代谢物质的含量变化及过氧化物酶、过氧化氢酶活性变化。4.采用酶联免疫法,研究不同生长时期中穿心莲植株内源激素含量的变化,包括生长素、脱落酸、赤霉素、细胞分裂素的含量变化。5.采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法,研究化学诱变对穿心莲植株不同组织器官的过氧化物酶、多酚氧化酶、酯酶等同工酶酶谱的变化。6.采用高效液相法,研究化学诱变对穿心莲植株主要活性成分穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量的影响。7.基于分子技术,研究不同化学诱变剂诱导后的穿心莲植株关键酶ApCPS基因的相对表达量的差异。结果:本研究主要取得的研究结果如下:1.研究发现化学诱变剂诱导后的3组穿心莲种子出根和萌芽时间延长,种子受到抑制,且出根率和萌芽率也相应降低,根长和苗高也受到了影响。特别是秋水仙素组的出根率最低只有62.92%,而萌芽率最低的氨磺乐灵组只有0.50%。且氨磺乐灵组的根长和苗高数值最低,受到的抑制影响最大。综合可知,经化学诱变剂诱导后的种子生长情况如下:对照组≈EMS组>秋水仙素组>氨磺乐灵组。2.研究发现穿心莲在诱变后从生长时间上来看,氨磺乐灵组生长最缓慢。并且在生长过程中也出现了很多变异株,其中氨磺乐灵组共观察到307株变异株,突变总频率75.25%,变异特点表现为叶变黄,叶色变深,顶叶退化,叶异型,以及叶异型且深的变异株;EMS组共观察到97株变异株,突变频率为43.32%。共包括叶变色,叶白斑,叶卷曲、叶异型的突变形态;秋水仙素组共观察到168株变异株,突变频率只有25.26%。共包括叶花斑,叶变色,真叶异型、真叶心形、子叶退化、子叶卷曲、叶长形、1顶叶退化、2顶叶退化、三真叶、叶缘锯齿等突变形态。且其中经鉴定,氨磺乐灵诱变的四倍体概率为12.32%,秋水仙素诱变的四倍体概率为4.31%。同时对氨磺乐灵、秋水仙素诱导的四倍体植株与对照组植株进行了比较,结果表明四倍体植株株型更矮、茎直径更粗,叶片表面质感明显增厚,叶色更为浓绿,花枝总长更短,花蕾数更多,果实更大。3.研究发现经化学诱变剂诱导后,在7月至10月期间,穿心莲的可溶性糖的含量呈上升的趋势,特别是氨磺乐灵组和秋水仙素组,其含量明显高于其他的两组。而可溶性蛋白含量呈现先降低后升高的状态,并且氨磺乐灵组与秋水仙素组的含量都高于EMS组与对照组。在叶绿素的含量测定中发现EMS组的叶绿素含量最低,而氨磺乐灵组和秋水仙素组的含量高,可能与诱导过程中化学诱变剂造成叶片颜色差异有关。对于丙二醛的含量测定,EMS组和对照组的丙二醛含量呈下降趋势,而氨磺乐灵组与秋水仙素组却是先升高后下降的变化趋势。POD活性也出现了明显的下降,其中氨磺乐灵组和秋水仙素组的植株POD活性一直高一些。CAT活性中氨磺乐灵组的最高,而EMS组和对照组相差不大,且活性最低。4.研究发现经化学诱变剂诱导后,在7月至10月期间,穿心莲植株的ZR含量变化以EMS组与秋水仙素组的变化趋势比对照组的差别明显。对于ABA含量,诱导后3组整体的ABA含量都低于对照组,但3者的差异不大。IAA含量的变化特点是EMS组和秋水仙素组IAA含量明显低,只是氨磺乐灵组在8月份时出现了一个明显的含量高峰。而3个诱导组穿心莲植株GA3含量的变化影响差异都不大,仅在个别月份呈现明显变化。5.研究发现经化学诱变剂诱导后,穿心莲植株不同组织器官的过氧化物酶、多酚氧化酶、酯酶这三种酶的酶带也有差别,以秋水仙素四倍体组的酶带数最多为21条,EMS组酶带数最少,只有17条,而氨磺乐灵四倍体组和对照组酶带数都为20条。同时,根据相对迁移率的大小,共得到17条不同迁移率酶带带位,其中氨磺乐灵四倍体组有14条谱带,EMS组有12条谱带,秋水仙素四倍体组有15条谱带,对照组也有15条谱带;但在位置、条数或活性大小上均差异显著,以四倍体的植株活性更大。6.研究发现经化学诱变剂诱导后,穿心莲植株的不同穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量变化如下:秋水仙素四倍体组穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量分别为4.16%和0.16%,氨磺乐灵四倍体组穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量分别为4.44%和0.10%,明显高于EMS组的2.69%、0.02%和对照组中的2.12%、0.09%。即对于秋水仙素四倍体组和氨磺乐灵四倍体组来说,其总内酯量4.32%、4.54%,达到对照组2.21%含量的1.95～2.05倍。7.研究发现经化学诱变剂诱导后,穿心莲的关键酶基因的相对表达量也有差别,其中以对照的相对表达量为1,其秋水仙素四倍体组与氨磺乐灵四倍体组的穿心莲植株ApCPS基因的相对表达量为2.135819、2.747887,高于对照组穿心莲相对表达量的2倍左右。结论:1.经化学诱变剂诱导后,穿心莲种子的生根、萌发都受到了一定程度的影响,特别是经氨磺乐灵诱导后,萌发受到明显抑制,并且诱导后,穿心莲植株生长过程中出现了很多的变异群体,并且对其中诱导出的四倍体穿心莲形态指标进行测定,发现氨磺乐灵的四倍体诱变率更高,达到12.32%,并且各项指标显示四倍体的植株相对于对照植株株型更矮、茎直径更粗,叶片表面质感明显增厚,叶色更为浓绿,花枝总长更短,花蕾数更多,果实更大。2.在化学诱变剂诱变过程中,穿心莲植株的生理代谢指标、内源激素以及同工酶谱带都有不同程度的变化,可作为其生理响应机制研究的相关参考依据。3.经化学诱变剂诱导后,穿心莲植株的主要活性成分(穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯)含量与关键酶ApCPS基因相对表达量之间成正比关系变化,并且发现四倍体的穿心莲植株含量和表达量都比对照植株增加了 2倍左右,为穿心莲倍性育种提供了参考价值。本研究通过对不同化学诱变剂诱导穿心莲种子,观察诱变过程中穿心莲植株的变化,发现诱导后的植株从形态上、生理生化指标上、同工酶活性和两种主要的内酯类成分(穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯)含量上,以及关键酶ApCPS基因的相对表达量上都存在不同程度的差异,从生理、生化和分子水平三个方面揭示了化学诱变过程对穿心莲的生理学响应机制的影响。