论文部分内容阅读
近年来,我国重金属镉(Cd)污染土地面积日益增多,Cd是一种剧毒重金属,是生物非必要元素之一,被国际癌症研究中心(IARC)等国际组织列为环境风险首要控制元素之一。茄科植物番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)在世界范围内广泛种植,在世界蔬菜作物中占有重要地位。然而,随着化肥、农药等应用日益增多,土壤中重金属残留的问题逐渐突出。番茄受到重金属的毒害作用后表现出生长发育缓慢、叶片枯黄等生理障碍。重金属胁迫环境严重制约了番茄的安全生产,因此挖掘番茄耐重金属胁迫相关基因尤为重要。
糖基转移酶是多糖合成的关键酶,同时也是催化糖基反应的酶,在非生物胁迫下发挥着重要的作用,主要调节激素稳态、次生代谢、抗逆性等。植物糖基转移酶在植物逆境研究中具有重要意义,其通过一系列的蛋白质修饰参与了植物体对非生物胁迫的抵抗作用。本实验室前期通过RNA-Seq测序技术筛选获得一个番茄糖基转移酶基因受到Cd胁迫诱导上调表达,因此本试验对该基因进行进一步的研究,结果如下:
(1)番茄SlUDP基因的克隆及生物信息学分析
首先利用同源克隆法获得UDP全长的cDNA序列,进行生物信息学分析。结果显示,SlUDP蛋白质二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和延伸链等构成,系统进化树分析发现,SlUDP与甜辣椒的亲缘关系最近,其次是马铃薯和花叶烟草,支持率达到98%。
(2)Cd胁迫下番茄SlUDP基因的表达模式分析
通过实时荧光定量PCR对SlUDP基因在不同时间、不同浓度重金属Cd胁迫条件下的表达模式进行分析,结果显示,该基因在番茄各组织部位均有表达,且在叶中表达量最高,为主茎中表达量的8.4倍。
(3)番茄SlUDP基因在酿酒酵母中功能鉴定
将SlUDP基因载体转入酵母感受态INVSC1中获得重组酵母,通过对其进行不同浓度的Cd处理,发现重组酵母提高了Cd的耐受性,在100μmol/L处理时对照在稀释1000倍下菌落未发现生长,而INVSC1-pYES2-SlUDP在菌落仍可以生长,结果显示SlUDP基因能提高重组酵母对重金属Cd胁迫的耐受性。初步鉴定了SlUDP基因与重金属Cd胁迫的功能,为研究SlUDP基因在拟南芥中的作用提供了一定的基础。
(4)过表达SlUDP基因拟南芥在重金属Cd胁迫下的功能鉴定
对过表达SlUDP基因拟南芥T3代植株进行Cd胁迫处理,分别对其种子萌发率、成株表型、根长、胁迫相关生理指标和基因表达量进行分析。利用不同浓度(40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L)的CdCl2处理,结果表明,在80μmol/LCdCl2处理下,第3d过表达拟南芥的萌发率可达35%,而野生型拟南芥的萌发率只接近15%。土培拟南芥过表达植株的存活率达到50%以上,而野生型拟南芥的存活率不足10%。并对拟南芥可溶性糖、MDA、POD、SOD进行了检测,结果发现,转基因拟南芥的可溶性糖、MDA、POD、SOD的含量显著高于野生型,说明转基因株系能够通过调节体内可溶性糖、MDA、POD、SOD的含量来响应胁迫,提高植株对Cd胁迫的耐性。为了进一步研究SlUDP基因在Cd胁迫中的作用,选取了与重金属转运相关基因检测其表达量。结果显示,过表达拟南芥中ZIP1、IRT1和CSD1基因的表达量显著高于WT。因此我们进一步推测SlUDP基因通过活性氧清除系统和金属离子转运相关途径提高植株对Cd胁迫的耐受性。
糖基转移酶是多糖合成的关键酶,同时也是催化糖基反应的酶,在非生物胁迫下发挥着重要的作用,主要调节激素稳态、次生代谢、抗逆性等。植物糖基转移酶在植物逆境研究中具有重要意义,其通过一系列的蛋白质修饰参与了植物体对非生物胁迫的抵抗作用。本实验室前期通过RNA-Seq测序技术筛选获得一个番茄糖基转移酶基因受到Cd胁迫诱导上调表达,因此本试验对该基因进行进一步的研究,结果如下:
(1)番茄SlUDP基因的克隆及生物信息学分析
首先利用同源克隆法获得UDP全长的cDNA序列,进行生物信息学分析。结果显示,SlUDP蛋白质二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和延伸链等构成,系统进化树分析发现,SlUDP与甜辣椒的亲缘关系最近,其次是马铃薯和花叶烟草,支持率达到98%。
(2)Cd胁迫下番茄SlUDP基因的表达模式分析
通过实时荧光定量PCR对SlUDP基因在不同时间、不同浓度重金属Cd胁迫条件下的表达模式进行分析,结果显示,该基因在番茄各组织部位均有表达,且在叶中表达量最高,为主茎中表达量的8.4倍。
(3)番茄SlUDP基因在酿酒酵母中功能鉴定
将SlUDP基因载体转入酵母感受态INVSC1中获得重组酵母,通过对其进行不同浓度的Cd处理,发现重组酵母提高了Cd的耐受性,在100μmol/L处理时对照在稀释1000倍下菌落未发现生长,而INVSC1-pYES2-SlUDP在菌落仍可以生长,结果显示SlUDP基因能提高重组酵母对重金属Cd胁迫的耐受性。初步鉴定了SlUDP基因与重金属Cd胁迫的功能,为研究SlUDP基因在拟南芥中的作用提供了一定的基础。
(4)过表达SlUDP基因拟南芥在重金属Cd胁迫下的功能鉴定
对过表达SlUDP基因拟南芥T3代植株进行Cd胁迫处理,分别对其种子萌发率、成株表型、根长、胁迫相关生理指标和基因表达量进行分析。利用不同浓度(40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L)的CdCl2处理,结果表明,在80μmol/LCdCl2处理下,第3d过表达拟南芥的萌发率可达35%,而野生型拟南芥的萌发率只接近15%。土培拟南芥过表达植株的存活率达到50%以上,而野生型拟南芥的存活率不足10%。并对拟南芥可溶性糖、MDA、POD、SOD进行了检测,结果发现,转基因拟南芥的可溶性糖、MDA、POD、SOD的含量显著高于野生型,说明转基因株系能够通过调节体内可溶性糖、MDA、POD、SOD的含量来响应胁迫,提高植株对Cd胁迫的耐性。为了进一步研究SlUDP基因在Cd胁迫中的作用,选取了与重金属转运相关基因检测其表达量。结果显示,过表达拟南芥中ZIP1、IRT1和CSD1基因的表达量显著高于WT。因此我们进一步推测SlUDP基因通过活性氧清除系统和金属离子转运相关途径提高植株对Cd胁迫的耐受性。