寻常型天疱疮（pemphigus vulgaris,PV）是发生在皮肤粘膜,以红斑、表皮内水疱、糜烂面为主要临床表现的自身免疫性大疱病。免疫功能的紊乱是PV发生发展的原因之一。PV患者体内除存在自身抗体外,还存在着CD4+T细胞数量的异常以及其亚群比例的失衡。因此,近年来针对PV的研究由体液免疫逐渐转向以CD4+T细胞为主的细胞免疫。然而,CD4+T细胞的变化是否可以作为评价PV疾病活动程度进展的临床指标目前仍不清楚;PV中CD4+T细胞亚群比例失衡的可能机制及其与疾病活动相关的棘层松解之间的关系也尚不清楚。因此,本课题通过回顾临床队列以及体外实验探索上述问题。第一部分临床实验室指标作为评价寻常型天疱疮患者疾病活动程度的效用:一项单中心回顾性研究[目的]目前针对PV患者疾病活动程度的评价体系对临床实验室检查指标的关注较少,并且这些指标的变化可能早于皮损的出现。然而,这些指标的变化与疾病活动程度之间的关系尚不清楚。因此,本研究评估以淋巴细胞亚群为主的临床实验室指标作为反映PV患者疾病活动程度的效用。[方法]回顾性分析2013年1月至2022年5月昆医附二院皮肤科住院部收治的疾病处于活动状态,且入院前未系统使用过糖皮质激素或至少近两月接受最小限度治疗（≤1Omg/d泼尼松）以及未使用过利妥昔单抗的PV患者病例资料。根据PDAI评分将这些病例分为三组:轻度（0-8）、中度（9-24）和重度（≥25）。收集PV患者入院时的抗桥粒芯糖蛋白（desmoglein,Dsg）抗体水平、血液学生物标志物、白球比（albumin to globulin ratio,A/G）、血脂和淋巴细胞亚群百分比的情况。比较不同疾病活动程度的患者间各项实验室指标的差异,随后使用Spearman相关系数（rs）评估变量与PDAI评分之间的相关性。采用多元线性回归分析（Stepwise法）确定PDAI评分（PV疾病活动程度）与相关实验室指标的数值关系。[结果]（1）纳入2013年1月至2022年5月期间211名PV患者病例资料。依据PDAI评分,轻（0-8）、中（9-24）、重（≥25）PV患者分别为21例（9.95%）、124 例（58.77%）和 66 例（31.28%）。（2）抗 Dsg1 抗体水平（rs=0.356,P＜0.001）、抗Dsg3抗体水平（rs=0.222,P=0.007）、中性粒细胞计数（rs=0.161,P=0.019）、血小板计数（rs=0.199,P=0.004）、中性粒细胞/淋巴细胞（neutrophil-to-lymphocyte ratio,NLR）（rs=0.155,P=0.024）以及血小板/淋巴细胞（platelet-to-lymphocyte ratio,PLR）（rs=0.210,P=0.002）与 PDAI 评分的升高呈正相关。A/G 值（rs=-0.269,P＜0.001）、低密度脂蛋白（rs=-0.142,P=0.047）、CD4+T 细胞百分比（rs=-0.337,P=0.007）以及 CD4/CD8 比值（rs=-0.277,P=0.030）与PDAI评分的升高呈负相关。（3）多元线性回归分析显示与PDAI评分相关的因素为较高的抗Dsg1抗体水平（P=0.001）和NLR值（P=0.006）以及较低的A/G值（P＜0.001）以及CD4+T细胞百分比（P=0.042）。[结论]（1）CD4+T细胞占比的减少可能与PV发病时疾病活动的进展有关。（2）较高抗Dsg1抗体水平和NLR值再联合较低的A/G值以及CD4+T细胞百分比可以解释PDAI评分,且与PDAI评分升高相关。这些发现肯定了 CD4+T细胞在PV疾病活动进展过程中的作用并为基于实验室指标反映PV疾病严重程度提供更全面和客观的评估体系。第二部分SOCS3低表达的CD4+T细胞通过激活STAT通路促进寻常型天疱疮患者Th1和Th17细胞分化并加重棘层松解[目的]在第一部分回顾性临床队列研究中发现PV患者CD4+T细胞占比的降低与其疾病严重程度的增加有关。且既往的研究表明CD4+T细胞亚群比例及其分泌的细胞因子在疾病发生发展过程中存在失衡,但引起这一现象的机制以及失衡的CD4+T亚群细胞与棘层松解的关系尚不清楚。因此,本研究寻找PV患者CD4+T细胞与健康志愿者之间的差异基因,并探究差异基因对CD4+T细胞亚群的影响以及比例失衡的CD4+T细胞亚群对棘层松解的影响。[方法]（1）同“第一部分”入排标准纳入PV患者,收集检测PV患者外周血中CD4+T细胞亚群（Th1、Th2、Th17以及Treg细胞）比例及其分泌的细胞因子的变化,并分析上述内容与疾病严重程度（PDAI评分）或抗Dsg抗体水平间的相关性。（2）通过二代测序检测并分析PV患者和健康志愿的CD4+T细胞中的差异mRNA。在测序结果中我们发现细胞信号转导抑制因子3（Suppressors Of Cytokine Signaling 3,SOCS3）在 PV 患者 CD4+T 细胞中显著低表达,因此针对该mRNA进行后续的探究。（3）PCR检测PV和健康志愿CD4+T细胞中SOCS3、STAT1以及STAT3 mRNA表达情况。（4）设计合成3条靶向SOCS3基因的shRNA干扰序列,在体外转染来自健康志愿者的原代CD4+T细胞,收集转染后72h各组CD4+T细胞分别进行PCR扩增在基因水平上验证沉默效率,并筛选最佳的shRNA干扰序列。（5）利用最佳的shRNA干扰序列制备SOCS3基因沉默的原代CD4+T细胞,流式细胞仪以及ELISA分别检测转染72h、96h以及120h后CD4+T细胞亚群（Th1、Th2、Th17以及Treg细胞）比例及其分泌的细胞因子表达量的变化。PCR检测转染后72h CD4+T细胞中STAT1以及STAT3 mRNA 的变化。WB 检测转染后 72h CD4+T 细胞中 p-STAT1、STAT1、p-STAT3以及STAT3蛋白表达量的变化。（6）分离纯化来自PV患者血清中的致病IgG并与HaCaT细胞共同孵育在体外构建PV棘层松解的细胞模型,并通过免疫荧光检测Dsg3以及细胞裂解实验验证细胞模型构建情况。（7）在体外构建SOCS3基因沉默的原代CD4+T细胞-棘层松解细胞模型共培养体系。在共培养两天后,收集CD4+T细胞通过流式细胞仪检测CD4+T细胞亚群（Th1、Th2、Th17以及Treg细胞）比例的变化,WB检测CD4+T细胞中p-STAT1、STAT1、p-STAT3以及STAT3的蛋白表达量,ELISA检测培养CD4+T细胞的上清中相应细胞因子的表达量;收集HaCaT细胞通过PCR检测HaCaT细胞中炎症因子mRNA表达量的变化,细胞裂解实验以及WB检测棘层松解情况。[结果]（1）PV患者外周血中Th1（P=0.016）、Th17细胞比例（P=0.045）、Th17/Treg（P=0.042）以及血清中IFN-γ（P=0.013）显著升高。（2）与健康志愿者相比较,PV患者CD4+T细胞中SOCS3 mRNA显著降低（P=0.008）,而STAT1（P=0.043）及 STAT3（P=0.004）则显著升高。（3）在转染 72h 后,shSOCS3-1、shSOCS3-2、shSOCS3-3组中SOCS3 mRNA表达水平均较shControl组显著下降,其中转染shSOCS3-1的CD4+T细胞在转录水平上的SOCS3表达下降了 85%（P＜0.001）。因此,转染shSOCS3-1的CD4+T细胞被用于后续实验。（4）转染72h 后,与 CD4+T-shControl 组相比,CD4+T-shSOCS3-1 组中 Th1（P＜0.001）、Th17（P=0.006）、Treg（P＜0.001）细胞比例显著升高;且在转染120h后,以Th1、Th17细胞比例增加较为显著,增长比例分别为50.33%以及38.94%。（5）转染72h后,与CD4+T-shControl组相比,CD4+T-shSOCS3-1组中细胞培养上清中的 IFN-γ（P＜0.001）、IL-17（P=0.001）以及TGF-β（P=0.004）表达量显著升高;且转染120h后的结果与转染72h后的结果一致。（6）转染72h后,与CD4+T-shControl组相比,CD4+T-shSOCS3-1 组 CD4+T 细胞中 STAT1（P=0.004）和STAT3 mRNA（P=0.033）,以及 p-STAT1（P=0.001）和 p-STAT3（P=0.003）的蛋白表达量均显著升高。（7）PV-IgG与HaCaT细胞共同孵育后,与HaCaT-PBS组及 HaCaT-HC-IgG 组相比,HaCaT-PV1-IgG 组（P=0.001,P=0.007）以及HaCaT-PV2-IgG组（P＜0.001,P=0.001）中细胞碎片数量显著增加,并且细胞间Dsg3的连续荧光被破坏。此外,经PCR检测结果显示IL-6（P=0.001,P=0.036）以及 IFN-γmRNA（P＜0.001,P=0.001）显著高于 HaCaT-PBS 组以及HaCaT-HC-IgG组。（8）在共培养体系中主要检测了与Th1及Th17细胞相关的指标变化,与其余各组相比,CD4+T-shSOCS3-1+HaCaT-PV 1-IgG组中Th1（P＜0.001）和 Th17（P＜0.006）细胞比例,IFN-γ（P＜0.001）和 IL-17（P＜0.001）表达量、以及p-STAT1（P＜0.001）以及p-STAT3蛋白（P＜0.001）显著升高。（9）在共培养体系中,与其余各组相比,CD4+T-shSOCS3-1+HaCaT-PV1-IgG组中HaCaT细胞的细胞碎片数显著增加（P＜0.001）,而HaCaT细胞中Dsg3蛋白表达量（P＜0.001）显著降低。[结论]PV患者CD4+T细胞中存在SOCS3的低表达以及STAT的过度激活,并且在体外条件下降低SOCS3的表达使得CD4+T细胞向Th1以及Th17细胞过度极化。同时,由PV-IgG诱导的IFN-γ和IL-6介导的皮损局部炎症可加重这一现象。此外,由于SOCS3低表达的CD4+T细胞向Th1以及Th17细胞过度极化,进一步产生炎症因子,从而加重棘层松解。因而,上调PV患者CD4+T细胞中的 SOCS3,维持 IFN-γ/STAT1/SOCS3 和 IL-6/STAT3/SOCS3 通路的平衡,减少CD4+T细胞向Th1以及Th17细胞分化,进而可减轻PV患者的棘层松解。综上,我们将天疱疮的概念从以往所认为的以Th2介导为主的疾病转变到Th1/Th17协同介导的疾病。