第一部分骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定目的分别从小鼠下肢长骨的密质骨和骨髓中分离出间充质干细胞(MSCs),比较细胞量、增殖能力、免疫表型、诱导分化能力；将MSCs在体外培养系统中进行传代纯化和鉴定。方法1.取小鼠股骨和胫骨,采用骨组织贴壁法和全骨髓贴壁法分别分离MSCs;2.两种方法分离的原代细胞,分别进行细胞计数、生长曲线(MTT实验)、集落形成能力(CFU-F实验)、细胞免疫表型(流式细胞仪)、向成骨和脂肪细胞分化潜能(成骨成脂诱导分化实验)的检测;3.采用两种方法的更优者,将其原代细胞传代纯化,得到第3代骨髓间充质干细胞(BMSCs),通过细胞形态学表现、细胞免疫表型和成骨成脂诱导分化潜能检测鉴定细胞。结果1.骨组织贴壁法分离的原代细胞量略少于全骨髓贴壁法分离的细胞(P≥0.05)。生长曲线趋势和CFU-F实验均提示骨组织贴壁法分离的原代细胞的增殖能力强于全骨髓贴壁法分离的细胞：骨组织贴壁法分离的原代细胞亦含更多表达CD90和CD44的细胞(P值均<0.05),诱导分化实验提示原代细胞中有更多细胞成功向成骨和脂肪细胞分化；2.骨组织贴壁法分离的细胞传代至第3代,光镜下呈长梭形,旋涡状生长,排列紧密。高表达CD90与CD44,不表达CD45与CD34。经成骨和成脂诱导后,茜素红及油红0染色均呈阳性。结论采用骨组织贴壁法分离小鼠BMSCs是一种简单可行的分离方法,连续传代可得到纯度较高的BMSCs。与全骨髓贴壁法相比,骨组织贴壁法分离的原代细胞中含有更多的MSCs,增殖潜能明显改善。第二部分骨髓间充质干细胞分泌因子延缓白消安小鼠生精功能损伤的研究目的探索BMSCs对白消安损伤小鼠生精功能的干预作用,寻找并分析与精子发生有关的细胞黏附、生精细胞凋亡等方面的机制因素。方法1.从第3代BMSCs的体外无血清培养体系中收集培养液,超滤得到浓缩分泌因子(条件培养基,CM),记为MSC-CM,蛋白浓度定量为0.60mg/mL;以同样方法获取蛋白浓度相似的人胚肾(HEK)293细胞分泌因子作为对照组(293-CM)；2. BALB/c小鼠经腹腔单次注射40mg/kg烷化剂白消安(1pusulfan),设置生理盐水和二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照组。注射白消安后第4天透射电镜观察睾丸超微结构;第1、2、3、4周未睾丸称重并行苏木精-伊红(HE)染色观察曲细精管结构；第2周末聚合酶链反应(PCR)及蛋白质印迹法(western blot)检测睾丸中细胞连接基因N-钙黏蛋白(N-cadherin)、P-钙黏蛋白(P-cadherin)、紧密蛋白occludin、闭合小环蛋白(ZO-1)、细胞连接蛋白43(connexin43)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达,末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记(‘TUNEL)法检测睾丸组织中细胞凋亡：3. BALB/c小鼠腹腔单次注射40mg/kg白消安后,分为两组：注射MSCs分泌因子(MSC-CM)和293分泌因子组(293-CM)。分别在注射白消安后的第2天经尾静脉注射MSC-CM和293-CM各200μL,每3天注射1次,连续注射2周；注射后第2周末,取各组睾丸组织,PCR及、vestern blot检测N-cadherin、 P-cadherin、occludin、ZO-1、connexin43、ICAM-1的表达,TUNEL检测睾丸组织中生精细胞凋亡；第2、4周末行睾丸组织HE染色观察曲细精管结构变化；4.取TM4细胞(睾丸支持细胞株),分别加入3种不同的培养液(含10%MSC-CM、10%293-CM、10%胎牛血清[FBS]的Dulbecco modified Eagle medium/F12[DMEM/F12]),孵育16h。胰酶消化细胞,3组各取相同密度细胞接种2h,MTT法检测贴壁细胞活性；分别收集胰酶消化的3组细胞,分别加入异硫氰酸荧光素(FITC)-CD44及CD54抗体孵育,流式细胞仪检测细胞表面黏附分子CD44及CD54表达情况；5.取GC-1细胞(睾丸精原细胞株),分别加入3种不同的培养液(含2%FBS、10%MSC-CM+20mmol/L环磷酰胺[CP]+2%FBS,10%293-CM+20mmol/L CP+2%FBS的DMEM/F12),孵育16h,采用Annexin V/碘化丙啶(PI)染色和流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果1.白消安组睾丸重量在白消安注射4周内呈下降趋势,附睾重量在注射第2周到第4周明显下降(P值均<0.05)；白消安组曲细精管结构呈逐渐退化趋势：1-2周后曲细精管内近基底膜的精原细胞明显空泡化,细胞群与基底膜分离、脱落,3周后精原细胞和精母细胞大量空泡化,生精上皮紊乱,4周后曲细精管内细胞呈空泡化,仅剩基底膜上少量精原细胞和支持细胞；DMSO溶剂对照组小鼠睾丸、附睾重量及曲细精管组织结构均无明显异常。与DMSO对照组相比,第2周末白消安组睾丸组织的N-cadherin、P-cadherin、connexin43、ZO-1、ICAM-1的表达明显降低：曲细精管内生精细胞凋亡指数明显增加(P值均<0.05)；透射电镜提示白消安作用4天,睾丸组织中的紧密连接、缝隙连接和黏附连接等缝隙变宽,结构模糊、消失；2.与293-CM组比较,MSC-CM组小鼠睾丸组织切片HE结果提示细胞空泡化和细胞群分离情况改善(第2周末),曲细精管内仍有大量生精细胞(第4周末);注射第2周末的N-cadherin、P-cadherin和ICAM-1基因表达明显增加；曲细精管内生精细胞凋亡指数明显下降(P值均<0.05)；3.与10%FBS和10%293-CM组比较,10%MSC-CM组的贴壁TM4细胞显著增加；流式结果表明10%MSC-CM明显提高细胞CD54与CD44表达(P值均<0.05)；4.与10%293-CM+20mmol/L CP+2%FBS组比较,10%MSC-CM+20mmol/L CP+2%FBS组的GC-1凋亡率明显降低(P均<0.05)。结论1.BMSCs分泌因子有效保护白消安引起的小鼠生精损伤,可能与BMSCs分泌因子减少生精细胞凋亡与促进N-cadherin、P-cadherin和ICAM-1表达有关；2. BMSCs分泌因子能够促进TM4表面黏附因子CD54与CD44的表达,从而增强细胞黏附行为；3. BMSCs分泌因子对烷化剂环磷酰胺引起GC-1凋亡有保护作用。第三部分骨髓间充质干细胞分泌因子治疗模型小鼠无精子症的初步研究目的探索BMSCs分泌因子对小鼠无精子症的治疗效果,寻找与精子发生有关的减数分裂特异性基因、细胞黏附等方面的机制因素。方法1.BMSCs分泌因子(MSC-CM)及239细胞分泌因子(293-CM)获取同第二部分；2. BALB/c小鼠腹腔单次注射40mg/kg白消安,4周后行睾丸组织切片HE染色以确定无精子症模型(busulfan)的构建效果;同时设置DMSO对照组(control),检测模型组(busulfan)U对照组(control)的细胞连接基因(N-cadherin、P-cadherin、 ZO-1、occludin、connexin43)的表达;3.无精子症模型小鼠(第5周),随机分为3组：无干预(busulfan)、MSC-CM、293-CM组。MSC-CM组与293-CM组均为尾静脉注射各自分泌因子200pL,每3天注射1次,连续注射3周。第8周PCR扩增及western blot法检测睾丸中减数分裂基因,细胞周期蛋白A1(CyclinA1)、联会复合体蛋白3(Scp3)、无精子样缺失基因(Dazl)、Piwi样蛋白1(Miwi)、磷酸甘油酸激酶2(Pgk2)、维甲酸刺激因子8(Stra8)、DEAD box多肽4(Vasa),和细胞连接基因(N-cadherin、 P-cadherin、ZO-1、occludi、connexin43)的表达；4.TM4细胞生长到单层细胞完全融合时,用200μL移液管划痕,分别加入3种不同的培养液(含10%MSC-CM、10%293-CM、10%FBS的DMEM/F12),继续培养,在划痕时、划痕后6h和24h将划痕区域拍照,分析划痕面积改变：5.TM4细胞贴壁4h后,分别加入3种不同的培养液(10%MSC-CM、10%293-CM、10%FBS的DMEM/F12),继续培养24h,MTT法检测细胞活性和增殖情况。结果1.睾丸组织形态学结果显示成功建成小鼠无精子症模型(第5周),表现为曲细精管内细胞呈空泡化,精原细胞、精母细胞、精子细胞和精子几乎全部消失,基底膜仅存部分精原细胞和支持细胞；2.第8周MSC-CM组小鼠睾丸组织CyclinA1、Dazl、Miwi、Pgk2、Stra8、Scp3、 Vasa基因表达明显高于293-CM组(P均<0.05)；3.第5周与DMSO对照组(control)比较,无精子症模型(busulfan组)睾丸中的N-cadherin、ZO-1、occludin、connexin43表达呈抑制状态；第8周MSC-CM组睾丸组织中N-cadherin表达明显高于293-CM组(P均<0.05);4.划痕后6h,10%MSC-CM组划痕修复率明显高于10%293-CM组和10%FBS组：划痕后24h,10%MSC-CM组划痕修复率明显高于10%293-CM组;10%MSC-CM组的TM4细胞增殖能力强于10%293-CM组(P均<0.05)。结论1. BMSCs分泌因子促进小鼠无精子症模型睾丸中减数分裂基因CyclinA1、Dazl、 Miwi、Pgk2、Stra8、Scp3、Vasa与黏附基因N-cadherin的表达；2. BMSCs分泌因子促进TM4细胞体外移行和增殖能力。