论文部分内容阅读
棉花的耐盐性较强,是开发盐碱地的先锋作物,但是棉花品种间的耐盐性差异很大,高盐胁迫严重影响棉花的产量和品质,因此,利用基因工程提高棉花的耐盐性具有重要的意义。解旋酶是一类普遍存在于微生物、动物和植物中的动力蛋白分子。D NA解旋酶能够打开双链DNA并参与DNA的复制、修复、重组和转录,RNA解旋酶能够催化RNA二级结构的解旋并参与转录、核糖体的合成和翻译起始等过程。近年来研究发现,解旋酶不仅调控植物生长发育,而且在植物应答非生物胁迫过程中起重要作用。实验室之前从盐生植物罗布麻中克隆了一个盐诱导表达的DEAD-box解旋酶基因Av DH1(登录号:EU145588),构建p BI121表达载体,利用农杆菌介导法将其导入陆地棉常规栽培种鲁613中,初步鉴定了一些转基因棉花植株。本研究通过分子、生理生化和盐碱地种植等试验,对转Av DH1基因耐盐棉花进行了系统鉴定筛选,获得了耐盐性稳定的转基因株系,同时对罗布麻DEAD-box解旋酶Av DH1在棉花中的同源基因进行分析,利用转录组测序,分析盐胁迫条件下转基因株系和受体的基因差异表达,揭示DEAD-box解旋酶提高棉花耐盐性的分子机制,获得的主要结果如下:1.利用PCR、Southern和Northern分析,从分子水平上确定罗布麻DEAD-box解旋酶Av DH1已经整合入受体棉花基因组并且稳定遗传,选取三个纯合转Av DH1基因株系08-66、08-87、08-26进一步分析它们室内和田间鉴定的耐盐性。2.室内耐盐性鉴定表明:正常条件下转Av DH1基因棉花和对照棉花的生长状况和耐盐相关的生理指标差异不显著,盐胁迫处理条件下,转基因棉花种子的发芽率和植株的株高均显著高于对照,其叶片离子渗透和MDA含量均显著低于对照,转基因株系叶片SOD酶活性、脯氨酸含量和K+/Na+离子比均显著高于对照,而三个转基因株系之间的差异不显著。3.2013年和2014年在东营盐生植物园进行盐碱地实验,在中盐地块(ECe 9.8 ds m-1)和高盐地块(ECe 15.6dsm-1)对转Av DH1基因棉花的农艺性状进行鉴定。两年的盐碱地鉴定结果表明:在中盐地块上转基因株系08-66、08-87和08-26比对照棉花的籽棉产量分别高15.4%、17.9%和15.9%,而在高盐地块上分别高23.9%、26.4%和23.1%,转基因棉花产量的增加受益于铃数和铃重的增加。4.为了进一步研究转罗布麻DEAD-box解旋酶基因(Av DH1)提高棉花的耐盐性机制,利用RNA测序技术,对转基因耐盐棉花和受体鲁613棉花进行盐胁迫差异表达基因分析,结果表明:盐胁迫处理后,非转基因株系中共有1359个基因表达发生差异表达,转基因植株中共有1150个基因表达发生差异表达,其中751个基因上调表达,399个基因下调表达。选取部分差异表达显著的基因进行q RT-PCR验证,结果显示与RNA测序差异表达基因趋势基本一致。在差异表达基因中,有35个基因是耐盐相关的转录因子。对差异表达基因参与的主要代谢途径进行分析,鉴定了差异表达基因参与耐盐的主要代谢途径为:磷脂酰肌醇信号途径、过氧化物酶体途径、核糖体合成途径以及RNA降解途径等。5.利用生物信息学的方法,从雷蒙德氏棉花中鉴定了161个RNA解旋酶基因,并将它们分为DEAD-box、DEAH-box、和DEx D/H-box三个亚家族,其中,Av DH1和DEx D/H-box亚家族中Gr DEx D/H4和Gr DEx D/H30同源(蛋白水平同源性74%)。共线性分析表明Gr DEx D/H4和Gr DEx D/H30存在共线性关系,表达聚类分析表明,Gr DEx D/H4和Gr DEx D/H30在棉花不同组织和不同发育阶段高表达,表明Gr DEx D/H4和Gr DEx D/H30可能具有重要的作用。