开花是受多个基因控制的数量性状,适时开花有利于植物躲避不利外界环境并顺利繁殖后代;对于农作物而言,适时开花是获得稳定产量的前提条件。甘蓝型油菜是世界上重要的油料作物,具有重要的经济价值。按照其开花对春化的需求甘蓝型油菜被分为三种生态型:春油菜、半冬性油菜和冬油菜。QTL定位结合与拟南芥的比较基因组分析在油菜基因组中检测到大量控制开花的主效QTL位点和候选基因。尽管如此,甘蓝型油菜的开花调控机制还尚未清楚:1)主效开花QTL缺乏深入的分子机理解析;2)多数易受环境影响的微效QTL位点很少被检测更缺乏分子水平的研究;3)开花QTL/基因间的互作缺乏研究。为了进一步揭示甘蓝型油菜的开花调控,本研究分析了开花主效基因Bna A3.FRI与油菜生态型和适应性之间的关系,并深入解析了Bna A3.FRI调控开花的分子机制。此外,实验室前期利用早花亲本No.2127为供体亲本,晚花亲本中油821(ZY821)为轮回亲本,构建了染色体片段代换系。本研究利用已构建的代换系,通过连锁分析在A2染色体上定位到一个调控油菜开花的微效QTL位点。主要结果如下:1.甘蓝型油菜开花调控因子Bna A3.FRI的功能分析FRI是决定拟南芥开花和生态型的关键基因,通过激活开花抑制基因FLC的表达来抑制开花。甘蓝型油菜共包含四个FRI同源基因:Bna A3.FRI、Bna A10.FRI、Bna C3.FRI和Bna C9.FRI,连锁分析和关联分析同时表明Bna A3.FRI变异与油菜的冬春性分化和开花调控相关。本研究对5份冬油菜和5份春油菜的4个FRI拷贝进行测序分析发现其中三个拷贝Bna A3.FRI、Bna A10.FRI、Bna C3.FRI包含丰富的遗传变异,其中在Bna A3.FRI的ATG上游200 bp和2.2 Kb的基因区范围内共检测到30个多态性位点、在Bna A10.FRI和Bna C3.FRI基因区分别检测到30和50个多态性位点,而Bna C9.FRI这个拷贝的序列高度保守,没有检测到多态性位点。进一步利用In Del标记分别检测17份冬油菜中Bna A3.FRI、Bna A10.FRI、Bna C3.FRI的单倍型发现,所有的冬油菜都包含相同的Bna A3.FRI单倍型,但包含不同的Bna A10.FRI和Bna C3.FRI的单倍型。随后对另外20份不同生态型油菜中Bna A3.FRI进行测序分析,最终在Bna A3.FRI ATG上游200bp和2.2Kb的基因区共检测到33个多态性位点,包含5个In Del(两个In Del位于ATG上游)和28个SNP(全部位于基因区,其中16个SNP导致氨基酸序列缺失/突变)。这些多态性位点共构成了9种单倍型(其中包含3种主要单倍型hap1、hap2和hap8,分别出现10次、8次和5次)。将其中三个In Del开发为分子标记并对174份甘蓝型油菜品系进行Bna A3.FRI单倍型分析(marker-based haplotype,m HAP),共检测到三种主要单倍型:m HAP1(22.4%)、m HAP2(60.3%)和m HAP3(15.5%)。对不同生态型油菜的Bna A3.FRI基因型组成分析发现:冬油菜中m HAP1基因型的频率(17/17,100%)显著高于半冬性油菜和春油菜中m HAP1的频率(分别为8/118,6.8%和15/39,38.5%)。同时,对不同地区油菜的Bna A3.FRI基因型组成分析发现:亚洲地区油菜中m HAP1的频率(5/108,4.6%)和m HAP3基因型的频率(11/108,10.2%)显著低于m HAP2(90/108,83.3%);与之相反,欧洲地区的油菜中m HAP1的频率高达58.5%(24/41)。这些结果表明Bna A3.FRI基因型与油菜的生态型和地区适应性相关。分别对半冬性和春油菜中不同单倍型油菜的开花期进行比较发现,不同Bna A3.FRI单倍型的开花期存在显著性差异。进一步对Bna A3.FRI的hap1和hap2两种单倍型进行转基因功能互补验证发现:hap1和hap2都能激活拟南芥FLC的表达并推迟开花,但hap1的推迟开花的功能明显比hap2强。为了进一步分析Bna A3.FRI序列变异对其表达和功能的影响,我们利用hap1启动子驱动其他3种Bna A3.FRI单倍型表达(hap2,hap3和hap8),同时又用hap2的启动子驱动hap1表达。通过转化拟南芥进行功能比较发现:在替换启动子之后,hap1依旧可以显著激活拟南芥FLC表达并推迟开花;而hap2,hap3和hap8虽然可以推迟开花但功能明显比hap1弱。这些结果表明Bna A3.FRI基因区序列变异导致其功能弱化,并由此调控开花期变异。2.基于染色体片段代换系的花期QTL定位实验室之前通过构建全基因组染色体片段代换系(CSSL)得到多个表现为早花的家系,对BC4F1代进行前景选择和背景选择得到3个表现为早花的A2染色体片段代换系:3W066、3W071和3W081。3个株系的F2群体的平均开花期分别为:145.7±18.3天、84.3±34.14天和136.8±29.27天,都显著早于晚花亲本ZY821当年的花期(161.7±4.34天)。我们选择株系3W066(遗传背景恢复率为94.75%)进行后续的开花QTL定位,并利用16个SSR和In Del标记重新构建了A2染色体导入区段的遗传连锁图。分别在WH2011(2011/2012,半冬性环境)和GS2012(2012,春环境)中考察BC4F3和BC4F4群体的开花期,结合单株的基因型数据我们在两个环境中各检测到2个QTL位点:其中WH2011环境下q FTA2.1a和q FTA2.1b分别解释开花期变异的25.4%和49.1%;GS2012环境下q FTA2.2a和q FTA2.2b分别解释开花期变异的13.1%和3.7%。在半冬性环境下连续三年(WH2011、WH2012和WH2013)对BC4F3、BC4F4和BC4F5群体的基因型和表型进行分析,最终将q FTA2.1a定位在标记KH77和KH78之间,对应于甘蓝型油菜参考基因组245Kb的范围,该区段包含一个重要的开花基因Bna FT.A2。此外,利用精细定位过程中检测到的交换单株进行自交,共得到3种包含不同导入片段的近等基因系:NIL-1、NIL-2和NIL-3(NIL-1包含的片段最长并涵盖NIL-2和NIL-3中的导入片段,NIL-2包含q FTA2.1a和q FTA2.1b两个位点,NIL-3只包含q FTA2.1a位点)。这3个导入系和ZY821在2013/2014(WH2013)环境下的开花期分别为66.5±11天、140±8.94天、156.3±7.18天和163.1±2.03天;说明A2染色体导入片段包含两个以上开花调控位点且位点之间具有加性效应,而我们分离的q FTA2.1a只是其中一个微效QTL位点。