【摘 要】
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背景:禽流感是由禽类A型流感病毒（Avian influenza A）引起的一类家禽传染性疾病。近年来,报道了许多人感染禽流感病毒的病例。在所有已知的人类禽流感病例中,由H5N1亚型禽流感病毒引起的症状最严重,分布也最为广范。咖啡酸（Caffeic acid,CA）和绿原酸（Chlorogenic acid,CHA）是多种中药的活性成分,研究表明它们对流感病毒具有良好的抑制作用,可以作为影响病毒复
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背景:禽流感是由禽类A型流感病毒（Avian influenza A）引起的一类家禽传染性疾病。近年来,报道了许多人感染禽流感病毒的病例。在所有已知的人类禽流感病例中,由H5N1亚型禽流感病毒引起的症状最严重,分布也最为广范。咖啡酸（Caffeic acid,CA）和绿原酸（Chlorogenic acid,CHA）是多种中药的活性成分,研究表明它们对流感病毒具有良好的抑制作用,可以作为影响病毒复制和传播的流感病毒神经氨酸酶（NA）的抑制剂。但是人们对其与流感病毒神经氨酸酶蛋白具体的结合模式及相互作用的关键氨基酸位点并不十分清楚。本文的主要目的是通过分子模拟技术研究咖啡酸、绿原酸和流感病毒神经氨酸酶之间的相互作用模式,探讨咖啡酸和绿原酸抗流感病毒作用机制,并对以咖啡酸为先导化合物的全新抗流感病毒神经氨酸酶药物分子设计进行初步的探讨。实验方法:1.用同源建模的方法对H5N1禽流感病毒神经氨酸酶的空间结构进行预测;2.探索不同力场、不同水溶剂模型及不同介电常数下,对神经氨酸酶-奥司他韦（NA-OS）复合物体系的分子动力学（MD）模拟及MM-PBSA方法计算结合自由能结果的影响,筛选出最佳的计算模型;3.利用分子对接计算,研究咖啡酸、绿原酸与流感病毒神经氨酸酶蛋白的相互作用模型,分析其关键氨基酸位点;4.利用虚拟突变,对流感病毒神经氨酸酶蛋白上的关键氨基酸与咖啡酸、绿原酸的结合,作出进一步的讨论;5.对以咖啡酸为先导化合物的全新抗流感病毒神经氨酸酶药物的分子设计进行初步的探讨。结果:1.在PDB数据库中找到了与高致病性禽流感病毒H5N1（Anhui2005）神经氨酸酶的氨基酸序列同源性最高的三个模板,分别为3CKZ＿A（同源性96%）、3B7E＿A（同源性91%）及3TI4＿B（同源性90%）,利用Profile＿3D等方法评估初始模型,结果H5N1神经氨酸酶的387个氨基酸与其结构的相容性得分都在“0”以上,说明整体结构是合理的。2.在不同力场和水溶剂模型下,结合Gromacs与g＿mmpbsa工具来计算结合自由能,与公开发表的结合自由能值相比较,发现Amber99sb-tip3p-pdie4的计算模型能够模拟出正确的神经氨酸酶与小分子药物的空间结构,自由能值为-74.163±18.178k J/mol,其与参考值相符合。因此将Amber99sb-tip3p-pdie4作为最后推荐的最佳计算模型。3.咖啡酸与绿原酸都通过药物分子上的供氢体与受氢体,和神经氨酸酶活性腔中的Arg292、Arg371等位点形成氢键,用Amber99sb-tip3p-pdie4模型计算结合自由能,NA-CA和NA-CHA分别为-86.429±25.546和-52.015±19.987k J/mol,表明咖啡酸与神经氨酸酶的结合力要远强于绿原酸及奥司他韦与神经氨酸酶的结合力。4.以咖啡酸为先导化合物,利用片段生长的方法设计出了潜在的4个全新神经氨酸酶抑制剂C5-1、C5-2、C5-3及C5-4,它们与神经氨酸酶的结合自由能分别为-128.832±22.543、-99.296±26.942、-106.073±23.256和-88.657±19.646k J/mol。结论:咖啡酸、绿原酸分别通过其共有苯环上与奥司他韦相类似的结构,与流感病毒神经氨酸酶分子上的Arg292、Arg371位氨基酸形成氢键,发挥抗流感病毒的作用。以咖啡酸为先导化合物的药物分子设计,可以为开发全新的抗流感病毒药物提供理论上的支持。
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